Характеристика структуры-функции липидно-белковой мембраны с использованием двухслойных слоёв интерфейса капель

В этой работе мы изучаем, как физические и электрические свойства липидных мембран и их окружающей среды влияют на проводимость ионов в двухслойных моделях с интерфейсом капель. Традиционная электрофизиология патч-клампов не изучает биофизику мембран в большем масштабе, но эта платформа охватывает как одноканальную активность, так и мембранные площади большего размера в миллиметре для более глубокого изучения биофизики мембран. Для начала подготовьте электроды из серебряной проволоки с хлорированным агарозным покрытием и растворы липидных пузырьков для электрофизиологических экспериментов.

Для формирования двухслойного интерфейса капель разместите прозрачную чашку Петри на сцене перевёрнутого микроскопа. Заполните блюдо алкановым маслом, например, 100% гексадеканом, на глубину примерно пять миллиметров. После прикрепления электродов к зажимной сцене и держателю заземляющего электрода используйте микроманипулятор, чтобы опустить оба шариковых конца с агарозным покрытием в масло на глубину примерно 2,5 миллиметра ниже поверхности масла, избегая быстрого движения и избежать столкновений с чашкой Петри.

Отрегулируйте фокус микроскопа так, чтобы оба конца шарика и их агарозные покрытия стали в чётком фокусе. Разместите электроды у края поля зрения, чтобы оба можно было наблюдать одновременно. Используя откалиброванную двухмикролитровую пипетку, аспирируйте экструдированные липидные пузырьки DPhPC, легированные грамицидином A. Медленно нанесите 250 нанолитров подвески непосредственно на каждый конц, покрытый агарозой, используя отдельный кончик пипетки для каждого, не касаясь агарозной оболочки.

Позвольте каплям распространяться по поверхности агарозы и заметно провисать вниз под действием гравитации и снижения поверхностного натяжения, образуя форму подвесной капли. Наблюдайте, как она провисается сбоку через стенку чашки Петри, если это чисто. Через пять минут аккуратно наведите антивибрационный стол, чтобы оценить каплю.

Убедитесь, что провисшие капли движутся с небольшой задержкой относительно движения электрода, что указывает на формирование полностью покрытых монослойных липидных капель. Если такое поведение не наблюдается, подождите ещё две-три минуты и повторите оценку. Убедитесь, что микроскоп, антивибрационный стол, клетка Фарадея, усилитель, дигитайзер, генератор функций и компьютер подключены к общей земле.

Организуйте соединения приборов согласно руководству производителя по настройке и настройте необходимую электрическую и оптическую систему, следуя подробным инструкциям для экспериментов с двухслойным интерфейсом капель. Настройте внешний генератор функций или выходной канал программного обеспечения для получения для генерации 10-герцовой треугольной волны напряжения. Подтвердите амплитуду и частоту на подключённом осциллографе и в программном обеспечении для получения информации.

После того как капли провиснут примерно на 10 минут, используйте микроманипуляторы, чтобы мягко приблизить две капли. Включите 10-герцовую треугольную форму 10-милливольтовой треугольной волны и отслеживайте ёмкостную отклик тока в программном обеспечении для счёта. Регулируйте площадь контакта капель, слегка сдвинув электроды до тех пор, пока ёмкостный отклик на форму сигнала не составит примерно от 100 до 200 пикоамперов.

Или площадь контакта не превышает примерно 1/4 диаметра капли. Ждите спонтанного образования бислоя, что электрически обозначается расширяющимся откликом ёмкостного тока от пика к пику, а оптически — увеличением внутреннего отражения с овальным видом в области контакта. Подтвердить, что чистые липидные бислои демонстрируют прямоугольные плато тока в ответ на треугольный стимул напряжения, тогда как двуслойные слои, легированные А-легированным грамицидином, демонстрируют наклонные плато, отражающие ансамблевую ионную проводимость.

После подтверждения стабильно-емкостных или проводящих ответов отключите треугольную волновую форму и дайте двуслойному интерфейсу капель уравновеситься не менее 15 минут перед применением протоколов стимуляции. В программном обеспечении для видеозахвата установите частоту кадров не менее 20 кадров в секунду. Выберите подходящие настройки камеры и объектива.

Далее нажмите «Приобрети» и выберите «Новый протокол». Во вкладке «Режим приобретения» выберите «Эпизодическая стимуляция». Устанавливайте забеги за пробу и свипы за пробег до одного.

Скорректируйте продолжительность прохода на четыре секунды больше, чем общая продолжительность эксперимента, обеспечивая двухсекундный базовый уровень до и после стимула. Установите частоту дискретизации в диапазоне от пяти до десяти килогерц. Во вкладке «Входы» назначите канал записи текущему входу.

А затем во вкладке «Выходы» назначите канал стимуляции выходному напряжению, управляющему электродами. Откройте вкладку Waveform. В столбце A установить тип на Step, уровень первого уровня и уровень дельта — на ноль милливольт, а первую длительность — на 2 000 миллисекунд, чтобы определить исходную границу до стимуляции.

В столбце B установите тип Pulse для парного облегчения импульсов. Укажите значения для амплитуды напряжения первого уровня и установите скорость поезда так, чтобы определить интервал между импульсами, соответствующий целевому рабочему циклу. Отрегулируйте ширину импульса до 100 миллисекунд.

В столбце C для парного подавления импульса установите тип на Pulse с той же амплитудой и длительностью импульса. Установите скорость поезда для достижения желаемого меньшего рабочего цикла и задайте ширину импульса. Далее, в столбце D, настройте параметры после стимуляции, идентичные исходной линии до стимуляции.

Ознакомьтесь с протоколом и сохраните его с описательным именем. Начните видеозапись и сразу же приступайте к электрическому захвату и стимуляции, нажав кнопку «Запись» в каждом из программ. В течение первых 60 секунд стимуляции наблюдайте, как ток увеличивается и может достичь плато.

В течение последних 60 секунд наблюдайте, как ток уменьшается. В конце протокола одновременно прекратите электрический захват и видеозапись. Наконец, выполните постобработку для извлечения площади мембраны и вычисления нормализованного тока, площади и потока на основе изображений и электрических данных.

Последовательные изображения запечатлели спонтанное бислойное заклинание и расширение площади, когда две провисшие капли соприкоснулись. Яркие внутренние овальные отражения в контакте с каплей использовались для оценки диаметра двуслоя и площади мембраны со временем. Парное облегчение импульсов с нуля секунд до 60 секунд и парное снижение импульсов с 60 до 120 секунд осуществлялись с помощью импульсов длительностью 100 миллисекунд.

Репрезентативные текущие реакции в течение периодов и паттерны стимуляции были зафиксированы. Нормализованный ток для двуслойных слоёв DPhPC с граммоцидином A-легированными в маслах гексадекана и додекана/гексадекана наблюдается при парной облегчении импульсов и парной депрессии импульсов. Нормализованная площадь мембраны, измеренная в 30 точках времени, показала аналогичную эволюцию площади в обоих условиях нефти, несмотря на разные течения.

Нормализованный поток отделял изменения проводимости, независимые от области, и был согласован с изменениями мембранной проводимости за пределами простого расширения площади. Длительное парное импульсное подавление стимуляции до 30 минут приводило к долгосрочному депрессионному поведению, в мембранах гексадекана, но сохраняло повышенный поток в мембранах додекана/гексадекана, что соответствует долгосрочному потенциационному поведению. Этот протокол позволяет нам измерять, как структура мембраны и ионная проводимость меняются посредством электрической реструктуризации двухслойных интерфейсов капель.

Эта платформа может поддерживать множество различных протоколов стимуляции с ионными каналами, без ионных каналов, а также фотоизомеризуемые каналы для лучшего анализа динамики мембран и электрических свойств. Поскольку эта настраиваемая платформа исследует как макромасштабную, так и микромасштабную биофизику мембран, будущие эксперименты значительно улучшится благодаря флуоресцентной спектроскопии для более уверенного разделения активности белковых каналов от мембранной поровой проводимости.