Выделение отдельных клеток из ранних эмбрионов Xenopus и их сортировка по размеру
20 марта 2026 г.
Мы описываем метод выделения отдельных клеток из ранних эмбрионов Xenopus laevis и их сортировки по размеру клеток.
Наши исследования сосредоточены на том, как размер клеток регулирует геномные и сульфатные решения в раннем развитии эмбриона. Существующие методы упускают из виду неоднородность размеров у ранних эмбрионов Xenopus. Этот протокол обеспечивает точное физическое разделение и сортировку по размеру ячеек.
Для начала добавьте примерно 15 миллилитров CMFM в новую 60-миллиметровую чашу Петри, покрытую гелем 1,5% AGROS. С помощью пластиковой трансферной пипетки переместите в чашку от 10 до 100 эмбрионов Xenopus laevis. Поставьте тарелку под стереомикроскопом.
Аккуратно захватите мембрану на поверхности эмбрионов одним пинцетом и снять мембрану другим пинцетом. Избегайте повреждения эмбрионов в этом процессе. Инкубировать девитални эмбрионы в CMFM в течение часа при комнатной температуре.
Аккуратно встряхивайте блюдо каждые пять минут, чтобы облегчить диссоциацию клеток. Проверяйте регулярно, пока не будет видно ни одной кучи бластомеров. Во время диссоциации бластомеров погружайте 40-метровые, 70-микрометровые и 100-микрометровые фильтры в отдельные чашки Петри, заполненные CMFM.
Расставьте блюда слева направо в указанном порядке. Поставьте две дополнительные тарелки с CMFM между группами для краткого мытья сита во время сортировки. Теперь аккуратно покрутите блюдо с отдельными одиночными бластомерами, чтобы обогатить их в центре.
Затем аккуратно переместить бластомеры в 40-микрометровый фильтр, погружённый в CMFM. Аккуратно потрясите сито несколько раз, чтобы бластомеры прошли, пропустив его размером менее 40 микрометров. Быстро переместите сито в тарелку с CMFM для краткого мытья.
Затем аккуратно перенесите бластомеры, удерживающиеся в сите, в 70-микрометровое сито. Повторяйте процедуру сортировки с помощью постепенно увеличенных сита, пока бластомеры не будут собраны в 100-микрометровом фильтре. Аккуратно помешайте каждое блюдо с отсортированными бластомерами, чтобы обогатить их в центре.
Затем аккуратно перенесите примерно четыре миллилитра бластомеров на поверхность 0,5 миллилитра среды с градиентом 15% плотности в флуоресцентно-активированной трубке сортировки клеток без смешивания. Через 10 минут целые бластомеры оседают на дно под действием силы тяжести, отделяя их от желтковых шариков, полученных из взрывных бластомеров. Неотсортированные управляющие и размерные одиночные бластомеры фиксировались и сфотографировались под яркополевой микроскопом.
Отсортированные бластомеры показали узкое распределение размеров в соответствующих ожидаемых диапазонах относительно контрольных неотсортированных бластомеров. Группа менее 40 микрометров показала средний диаметр примерно 33 микрометра. Группа с 40 до 70 микрометров показала средний диаметр примерно 55 микрометров, а группа более 70 микрометров — средний диаметр примерно 91 микрометр.
Этот протокол позволяет исследователям изучать функции и механизмы, опосредованные размером клетки. Самое важное для этого протокола — аккуратно обращаться с диссоциированными клетками, так как они хрупки. После этого протокола отсортированные клетки могут использоваться для анализа клеточных циклов, секвенирования отдельных клеток и конфокальной визуализации.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен метод выделения и сортировки одиночных клеток из ранних эмбрионов Xenopus laevis на основе размера клеток. Этот метод позволяет преодолеть ограничения существующих подходов, которые не учитывают неоднородность размеров, что облегчает изучение функций, связанных с размером клеток в процессе развития.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология развития
- Клеточная биология
- Эмбриология
Теоретическая часть
- Размер клеток является критическим фактором в развитии раннего эмбриона.
- Существующие протоколы недостаточно учитывают вариации размеров эмбрионов.
- Изоляция клеток по размеру может углубить понимание механизмов развития.
- Данный метод позволяет осуществлять точное физическое разделение клеток.
Цель исследования
- Предоставить надежный метод изоляции единичных клеток из эмбрионов.
- Обеспечить возможность сортировки клеток по размеру для дальнейшего анализа.
- Способствовать исследованию влияния размера клеток на биологию развития.
Используемые методы
- Использование среды CMFM и геля AGROS для манипуляций с эмбрионами.
- Физическое разделение бластомеров с помощью сит с определенным размером пор.
- Флуоресцентная сортировка клеток для последующего анализа.
- Осторожное обращение с хрупкими диссоциированными клетками.
Основные результаты
- Отсортированные бластомеры имели узкое распределение по размеру.
- Средние диаметры были зафиксированы для различных размерных групп.
- Данный протокол позволяет эффективно отделять целые бластомеры от желточных глобул.
- Отсортированные клетки могут быть использованы для различных последующих приложений.
Выводы
- Данный протокол представляет собой ценный инструмент для исследователей, изучающих влияние размера клеток.
- Он расширяет возможности анализа отдельных клеток в контексте развития.
- Тщательное соблюдение инструкции крайне важно для сохранения целостности клеток.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Точное выделение и сортировка одиночных клеток ранних эмбрионов Xenopus по размеру позволяют исследовать размерно-зависимые регуляторные механизмы в ходе раннего развития. Эта возможность устраняет критический пробел в понимании того, как гетерогенность размеров клеток влияет на решения в процессе развития, что повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней и снижении механистических рисков. Данный метод представляет собой масштабируемую платформу для создания стандартизированных популяций клеток с определенным размером для последующего использования в исследовательских и трансляционных рабочих процессах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить функциональные исследования влияния размера клеток на пути развития и регуляцию генома.
- Обеспечивает механистическую проверку гипотез путем выделения размера в качестве независимой переменной.
- Способствует валидации биологических мишеней за счет получения гомогенных популяций клеток для анализа сигнальных путей.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет получать валидированные суспензии одиночных клеток с определенным размером для воспроизводимой разработки анализов.
- Повышает стандартизацию анализа за счет контроля гетерогенности размеров клеток в скрининговых платформах.
- Обеспечивает количественное измерение фенотипов, зависящих от размера, для надежной оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Представляет собой модельную систему для изучения зависимых от размера регуляторных механизмов, имеющих значение для раннего развития.
- Обеспечивает непрерывность процесса от открытия до доклинической валидации, позволяя использовать такие последующие методы анализа, как секвенирование единичных клеток и визуализация.
- Способствует принятию взвешенных решений о дальнейшем продвижении исследований путем уточнения роли размера клеток в результатах развития.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол интегрируется в континуум открытий — от раннего тестирования гипотез до разработки анализа и трансляционных исследований, позволяя проводить механистические исследования на основе размеров и подготавливать стандартизированные клеточные препараты для последующего анализа.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о влиянии размера клеток и проясняет пути развития.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые популяции клеток с определенным размером для подготовки анализов и количественных результатов.
- Аналитика: Обеспечивает точное измерение распределения клеток по размеру и поддерживает статистическое сравнение экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Соответствует доклиническим рабочим процессам, обеспечивая возможность анализа живых клеток, секвенирования и визуализации отсортированных клеток.
- Корпоративное повторное использование: Создает переиспользуемый протокол для генерации стандартизированных популяций клеток в рамках нескольких исследовательских программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую точность и снижает механистическую неоднозначность в исследованиях развития.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую и масштабируемую сортировку клеток для различных областей НИОКР.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и эффективность использования капитала за счет уточнения биологических рисков, зависящих от размера.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию и продвижение программ на стадии открытия с учетом скорректированного риска.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с эмбрионами и диссоциацией одиночных клеток.
- Необходим доступ к стереомикроскопии, клеточным фильтрам, а также к инфраструктуре для визуализации или секвенирования.
- Требуется тщательная стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости сортировки по размеру.
- Может потребоваться адаптация для различных модельных систем или стадий развития.
- Практическими ограничениями, отмеченными в протоколе, являются хрупкость клеток и чувствительность к манипуляциям.
