Непрерывное культурное миллифлюидное устройство для изучения Escherichia coli в условиях низкого содержания и колебаний питательных веществ
7 июля 2026 г.
Мы представляем протокол для устройства для миллифлюидного непрерывного культивирования (MCCD), который позволяет выращивать бактериальные популяции в условиях постоянного низкого содержания питательных веществ (до сотен наномолярных концентраций) или временных флуктуаций питательных веществ в минимальное время.
Мои исследования сосредоточены на изучении того, как бактерии физиологически адаптируются к условиям с низким содержанием и изменяющимися питательными веществами, типичными для природных сред. Традиционные системы культивирования плохо воспроизводят условия с низким уровнем динамических питательных веществ, тогда как наша система позволяет выращивать культуру в этих экологически значимых условиях. Подготовьте ночную культуру за день до эксперимента.
Подготовьте прекультуру, добавив шесть микролитров ночной культуры в пробирку с шестью миллилитрами полноценной определённой среды (RDM). Разделите смесь поровну на две 15-миллилитровые пробирки и маркируйте их как A и B. Инкубировать обе трубки при 37 градусах Цельсия, встряхивая при 200 об/мин. Контролировать оптическую плотность на 600 нанометрах с помощью трубки B и не продолжать, пока оптическая плотность не достигнет примерно 0,5.
Во время инкубации подготовьте среду с низким уровнем RDM и распределите общий объём между бутылками на разные временные моменты. Затем запечатайте каждую бутылку крышками с тремя трубками. Подключите третью по ширине силиконовую трубку к вентиляционному фильтру диаметром 0,2 микрометра для стерильного обмена воздуха.
Прикрепите по одному концу каждой перистальтической трубки, оснащённой мужскими замками Luer, к силиконовым трубкам меньшего диаметра. Оставьте алюминиевую фольгированную крышку на свободном мужском штуцере Luer на другом конце перистальтических труб, пока эксперимент не начнёт предотвращать загрязнение. Поставьте бутылки и перистальтический насос в инкубатор, настроенный на 37 градусов Цельсия.
Закрепить все перистальтические трубки в каналах одной и той же головки насоса, обеспечив одинаковый расход по всем фильтрам. Разведите предкультуру в соотношении один к 10, добавив 600 микролитров посева в пробирку с 5,4 миллилитрами низкого RDM. Используя пипетку объёмом один миллилитр, введите по одному миллилитру разбавленной культуры в каждый из шести поливинилиденфторидных фильтров (PVDF) объемом 0,45 микрометра.
После промывания обратных клапанов автоклавной ультрачистой водой прикрепите их к концам фильтров. Снимите алюминиевые фольгированные крышки с фитингов труб. Подключите каждый фильтр к перистальтическим фитингам труб.
Установите расход на перистальтическом насосе на два миллилитра в минуту. Поставьте контейнер для отходов под фильтрами для сбора отходов и запустите поток. Через два часа отключите один из фильтров, подключённых к бутылке на один литр, открутите односторонние обратные клапаны и поставьте фильтр в 50-миллилитровую трубку центрифуга, направленную вниз.
Центрифугу при 2 000 G в течение двух минут. С помощью стерильного резака для труб приложите мягкое давление на выходной конец пластикового корпуса, чтобы открыть фильтр. Освободите внутренний цилиндр и сбросьте секцию, содержащую мембрану.
Промыйте внутренние стенки корпуса фильтра собранной культурной средой. Измерьте общий собранный объём с помощью пятимиллилитровой серологической пипетки. Возьмите три аликвота по 100 микролитров из образца и зафиксируйте их глутаральдегидом до конечной концентрации 1,5%. Отключите соответствующие фильтры в последующие моменты и повторите процедуру сбора.
Маркируйте собранные образцы в соответствии с их временными точками. Маркируйте образцы флуоресцентным красителем ДНК и подсчитайте клетки с помощью проточной цитометрии. Со временем преобразованные в логарифми 10 ячеек следовали линейным траекториям, что указывало на экспоненциальный рост во всех условиях.
Темпы роста составляли примерно 0,88 в час для условия 0,5% RDM, 0,64 в час для 0,25% и 0,18 в час для условия 0,01%. Количество клеток достигло до одного миллиарда клеток на образец, демонстрируя, что устройство для миллифлюидного непрерывного культивирования (MCCD) поддерживает как экспоненциальный рост, так и высокий выход биомассы при концентрациях питательных веществ между наномолярными и микромолярными веществами. Клетки, выращенные в 0,5% RDM, имели большую среднюю длину клеток, чем клетки, выращенные в 0,01% RDM.
Основная проблема при выращивании с низким содержанием питательных веществ — поддержание достаточной плотности клеток для предотвращения засоров, накопления давления и истощения питательных веществ. После этой процедуры клетки могут быть собраны для других последующих анализов, включая протеомику, метаболомику и другие омиксные подходы. В будущих исследованиях можно изучить адаптацию микроорганизмов к ограничению питательных веществ и флуктуациям, интегрируя этот протокол с количественным омикс-анализом.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлено устройство для непрерывного миллифлюидного культивирования (MCCD) — новая платформа, разработанная для изучения реакций микроорганизмов как на стабильные, так и на флуктуирующие условия содержания питательных веществ. MCCD преодолевает ограничения традиционных методов культивирования, обеспечивая точный контроль концентраций питательных веществ и временных колебаний, что максимально точно имитирует естественные среды обитания микробов. В протоколе подробно описана работа MCCD для культивирования таких бактерий, как Escherichia coli, в экологически значимых условиях с низким содержанием питательных веществ.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Микробная экология
- Биотехнология
Теоретическая часть
- Природные микробные среды обитания характеризуются низкими концентрациями смешанных питательных веществ, пространственной неоднородностью и временными колебаниями.
- Традиционные периодические культуры и хемостаты не позволяют адекватно воспроизвести эти условия окружающей среды.
- Микрофлюидные системы позволяют создавать динамические среды, однако в них не вырабатывается достаточное количество биомассы для анализа на популяционном уровне.
- Существует потребность в платформах для культивирования, которые обеспечивают контролируемые условия с низким содержанием питательных веществ и их колебаниями для проведения микробных исследований.
Цель исследования
- Разработать и продемонстрировать устройство для непрерывного культивирования, способное поддерживать стабильные или колеблющиеся условия с низким содержанием питательных веществ.
- Представить протокол эксплуатации MCCD как в режиме постоянного, так и в режиме колеблющегося уровня питательных веществ.
- Обеспечить возможность изучения роста и физиологии бактерий в условиях, максимально приближенных к естественной среде обитания.
Используемые методы
- Разработка и использование устройства MCCD с фильтром Sterivex (ПВДФ-мембрана 0.45 μm) для размещения бактериальных популяций.
- Непрерывный поток среды для поддержания стабильных условий культивирования и предотвращения истощения питательных веществ.
- Внедрение системы трехходовых электромагнитных клапанов, управляемой специализированным программным обеспечением Matlab, для точного контроля колебаний концентрации питательных веществ.
- Протоколы культивирования E. coli как в условиях постоянного, так и в условиях колеблющегося низкого содержания питательных веществ.
Основные результаты
- E. coli достигли экспоненциального роста в смесях аминокислот и нуклеиновых оснований в наномолярных концентрациях.
- Плотность клеток в условиях низкого содержания питательных веществ достигла приблизительно 109 клеток/мл.
- С помощью MCCD удалось успешно воссоздать ключевые особенности природных микробных сред в контролируемых лабораторных условиях.
- Данная система подходит для изучения других видов микроорганизмов, помимо E. coli.
Выводы
- MCCD позволяет проводить детальные исследования роста и физиологии микроорганизмов в экологически релевантных условиях с низким содержанием питательных веществ и их колебаниями.
- Данная платформа устраняет основные недостатки традиционных методов культивирования, используемых в исследованиях по экологической микробиологии.
- Устройство открывает возможности для новых экспериментальных подходов к изучению адаптации и поведения микроорганизмов в средах, приближенных к природным.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Исследования микроорганизмов на стадии открытия часто не позволяют воссоздать природные условия с низким и колеблющимся содержанием питательных веществ, что ограничивает прогностическую достоверность для трансляционного применения. Миллифлюидное устройство для непрерывного культивирования (MCCD) позволяет проводить контролируемые масштабируемые исследования роста и физиологии бактерий в экологически значимых условиях, обеспечивая надежную валидацию мишеней и снижение механистических рисков. Данная платформа повышает достоверность результатов на ранних стадиях для последующих этапов биофармацевтических исследований и разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать микробную адаптацию и метаболические пути в физиологически релевантных условиях питательной среды.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней за счет поддержания стабильной или колеблющейся среды с низким содержанием питательных веществ.
- Повышает достоверность прогнозирования поведения микробных систем в сложных сценариях реального мира.
Скрининг и разработка анализа
- Облегчает подготовку валидированных микробных культур для последующих омиксных и фенотипических анализов.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты за счет точного контроля концентрации питательных веществ и их колебаний.
- Позволяет стандартизировать анализы и масштабировать их для высокопроизводительного скрининга микробных ответов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит исследования микроорганизмов in vitro в соответствие с условиями биомаркеров, характерными для заболеваний или окружающей среды.
- Обеспечивает преемственность от этапа раннего поиска до доклинической валидации за счет имитации естественных сред обитания микроорганизмов.
- Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков путем снижения механистической неопределенности в микробных моделях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
MCCD вписывается в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, связывая раннюю проверку гипотез с последующей функциональной валидацией микробных систем.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы и уточнять метаболические пути в контролируемых условиях с низким содержанием питательных веществ.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых культур, готовых к анализу, для количественной оценки микробных фенотипов.
- Аналитика: поддерживает проведение омиксных анализов на популяционном уровне за счет получения достаточного количества биомассы и точного контроля условий окружающей среды.
- Трансляционные исследования: способствует приведению условий к соответствию с естественной средой или средой при патологии для проведения доклинических исследований.
- Корпоративное повторное использование: предоставляет многократно используемую платформу, адаптируемую к различным видам микроорганизмов и схемам экспериментов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неоднозначность при валидации микробных мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует условия культивирования и обеспечивает воспроизводимые, масштабируемые рабочие процессы.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет получения надежных данных на ранних этапах.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению микробных мишеней и моделей.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области культивирования микроорганизмов и эксплуатации флюидных систем.
- Необходимы приборы для непрерывного контроля потока и программируемой подачи питательных веществ.
- Требуется межкомандная стандартизация для обеспечения воспроизводимости экспериментов в разных лабораториях и на разных площадках.
- Метод может быть адаптирован для различных видов микроорганизмов с учетом совместимости мембран и потребностей в питательных веществах.
- Применимо только для исследований, в которых критически важны достаточный объем биомассы и точный контроль условий окружающей среды для последующих анализов.
