Лизосомное профилирование с помощью LysoTracker для количественной оценки клеточного старения у фибробластов человека

Мы изучаем клеточную старение и её характеристику, сосредотачиваясь на том, как такие признаки, как изменения лизосом, могут служить маркерами старения. Обычные маркеры старения часто основаны на конечных точках и бинарны, тогда как живые клетки могут считывать старение как непрерывный количественный сигнал в разных условиях. Для начала посейте фибробласты IMR-90 в пластине с 24 лунками и инкубируем их при 37 градусах Цельсия в инкубаторе с 5% углекислого газа, пока они не образуют субфлюентный монослой.

Запишите плотность посева и время между покрытием и лизосомным окрашиванием для каждого эксперимента. Разогрейте полную культурную среду до 37 градусов Цельсия. Подготовьте в среде рабочий раствор LysoTracker Deep Red объемом 75 наномоляров и защитите его от света.

Смешайте рабочий раствор мягкой инверсией. Отбирайте соответствующие когорты предстареющих и стареющих IMR-90 фибробластов, подготовленные с использованием определённого метода индукции старения. Подтвердите стареющий фенотип путём мониторинга характеристик роста и морфологии.

Вдыхайте отработанную среду из каждой скважины. Аккуратно добавляйте рабочее решение LysoTracker вдоль стенки каждой скважины, чтобы избежать нарушения монослойного слоя. Инкубировать клетки с помощью LysoTracker в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия в инкубаторе на 5% углекислого газа.

В последние 10 минут инкубации LysoTracker добавьте Hoechst 33342 непосредственно в колодцы по рабочей концентрации и смешивайте, аккуратно покачивая пластину. Удалите окрашивающую среду в конце инкубации и промывайте клетки один раз заранее нагретым PBS, чтобы уменьшить фоновый флуоресцентный эффект. Сразу после промывания добавьте заранее подогретый феноловый субстрат без красных культур.

Переходите непосредственно к живой ячеточной визуализации, поддерживая единообразное время от обмена буфером до сбора данных во всех скважинах. Помечайте параллельные колодцы в культивирующей пластине для окрашивания бета-галактозидазами, чтобы сравнить высокостареющие клетки с до-стареющими контролями. Завершение живой клеточной визуализации для валидационных яжек перед фиксацией.

Записывайте координаты ступени во время живого съемки, чтобы переместить те же поля после фиксации. Добавьте фиксационный раствор из комплекта для окрашивания старения бета-галактозидазы, содержащего 2% формальдегида и 0,2% глутаральдегида, в клетки. Накройте тарелку крышкой и инкубуйте 10–15 минут при комнатной температуре.

Снимите фиксатор и дважды прополосните колодцы PBS. Затем добавляйте в каждую яме раствор окрашивания бета-галактозидазы, содержащий субстрат X-гал при pH 6. Запечатайте пластину парапленкой, чтобы ограничить испарение во время инкубации, и поместите её в сухой инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия без углекислого газа на 12–16 часов.

После фиксации и окрашивания разместите пластину на стадии микроскопа и переместите те же поля изображения по зафиксированным координатам стадии. Осмотрите скважины под микроскопом Brightfield и задокументируйте узор окрашивания. Получите репрезентативные изображения для каждого состояния и определите долю положительных клеток бета-галактозидазы, связанных с старением, в каждой скважине.

Стареющие клетки демонстрировали яркие, пространственно расширенные области с парануклеарными лизосомами, тогда как до-сенесцентные контроли демонстрировали более низкий общий сигнал с дискретными пунктатными структурами. Стареющие состояния показали более высокую долю положительных клеток бета-гал, чем у до-сенесцентных контрольных групп. Была обнаружена сильная корреляция между интенсивностью LysoTracker и бета-гал-положительной областью, ассоциированной с старением, в репликационных скважинах.

Средняя интенсивность LysoTracker внутри позитивной маски была выше в стареющих культурах, чем в до-стареющих культурах, что делает её самым надёжным дискриминатором на уровне поля между этими двумя состояниями. Интегрированная интенсивность LysoTracker на ядро также была выше в стареющих культурах в представленном репрезентативном поле. Этот протокол позволяет исследователям измерять лизосомное ремоделирование в живых клетках, обеспечивая количественно измеримое одиночное измерение нагрузки и прогрессирования старения.

Важно сохранять одинаковые настройки окрашивания и визуализации во всех скважинах, так как сравнение интенсивности допустимо только за одну сессию. Будущие исследования могут расширить эту процедуру на трёхмерные модели, дополнительные типы клеток и валидацию в различных микроскопических системах и рабочих процессах.