Выявление потенциальных кандидатов в противотуберкулёзные препараты: пошаговое руководство по синтезу, определению MIC и оценке цитотоксичности в клетках млекопитающих

Основное внимание наших исследований уделяется разработке и валидации новых кандидатов в противотуберкулёзные препараты, направленных на развитие терапевтических стратегий. Конвейер профилактического фенотипического скрининга может использоваться при поиске новых фармацевтических препаратов против штаммов микобактерий туберкулёза. Для начала соберите необходимые реагенты и приступите к приготовлению реакционной смеси с использованием представленных пропорций.

Мешайте реакционную смесь при 85 градусах Цельсия в течение 16 часов. Используйте ротационный испаритель для удаления растворителя. Добавьте примерно 20 миллилитров насыщенного раствора бикарбоната натрия в остатки.

Фильтруйте эту суспензию с помощью 11-микрометровой целлюлозной качественной фильтрующей бумаги для сбора остаточных твердых веществ. Растворить остаточные твёрдые вещества в 50 миллилитрах хлороформа. Используйте разделительную воронку, чтобы промыть хлороформный раствор 15 миллилитрами воды три раза.

Каждый раз снимаю слой воды. Добавьте безводный сульфат натрия в органическую фазу, чтобы удалить остатки воды и высушить её. После испарения растворителя промыйте полученный зелёный твердый материал четыре раза 10 миллилитрами горячего гексана при температуре примерно 50 градусов Цельсия.

К одному миллиграмму соединения 6 добавьте один миллилитр однократной смеси ацетонитрила и метанола, чтобы получить стандартный раствор. Разведите стандартный раствор до 0,5 миллиграммов на миллилитр и отфильтруйте перед анализом. Загрузите образец в систему ВЭЖХ.

Используйте программное обеспечение для сбора хроматографических данных для получения и обработки данных. Установите хроматографический метод на использование колонки C18 с обратной фазой размером 250 на 4,6 миллиметра размером частицы размером пять микрометров. Установите расход на 1,5 миллилитра в минуту и установите обнаружение УФ-излучения на 254 нанометра.

Настройте градиент в соответствии с программированными изменениями фазового состава мобильных движений. Перенесите примерно 15–20 миллиграммов соединения 6 в ядерную магнитно-резонансную или ЯМР-трубку. Растворите его в соответствующем объёме DMSOD6.

После того как параметры получения будут установлены в представленном виде, получите спектр ЯМР протона с помощью стандартной последовательности импульсов. Корректируйте параметры получения информации. Запустите спектр ЯМР протона и углерода-13 и сообщайте о химических сдвигах в частях на миллион.

Визуализируйте и обработайте данные ЯМР с помощью файла распада свободной индукции, полученного в ходе эксперимента. Для хроматографической очистки соединения 6 упаковывают колонку силикагелем. Загрузите природный Compound 6 на колонну.

Элюируйте соединение и собирайте дроби. Отслеживайте фракции с помощью тонкослойной хроматографии и комбинируйте фракции, содержащие чистый продукт. Добавьте 100 микролитров бульона 7H9 с добавлением 10% альбуминовой декстрозы каталазы или ADC в 12-й колонку пластины с 96 лунками.

Затем переложите 100 микролитров бульона 7H9 с 10% ADC и 5% DMSO в колонку 11. А затем последовательно — от девятого до первого столбца. Добавьте 200 микролитров соединенного раствора в столбец 10, выделив по одной строке на каждую смесь.

Пипетка 100 микролитров соединенного раствора с концентрацией в два раза выше тестовой концентрации в колонку 12 пластины с 96 лунками. Переведите 100 микролитров из колонки 10 в колонку девять и хорошо перемешайте с помощью пипетирования, чтобы начать двойное разбавление злаков. Продолжайте последовательное разбавление последовательно до первой колонки.

Добавьте 100 микролитров бактериальной суспензии микобактерии туберкулёза последовательно от колонки 11 до столбца один и закройте пластину. Запечатайте пластину парапленкой и инкубуйте при 37 градусах Цельсия в течение семи дней. Затем добавьте 60 микролитров раствора 0,01% резазурина в каждую лунку пластины и накройте её.

Запечатайте пластину парапленкой и инкубуйте при 37 градусах Цельсия в течение 48 часов. Потом проверьте, не меняется ли цвет с синего на розовый. Приготовьте рабочий раствор с концентрацией 0,5 миллиграмма на миллилитр MTT в безсывороточном DMEM.

Получите клетки Vero и HEPG2, обработанные соединением 6 в течение 48 часов, и осмотрите их для оценки эффектов лечения. Аспирируйте среду из пластин и добавьте 50 микролитров рабочего раствора MTT в каждую скважину при низком окружающем освещении. После трёхчасовой инкубации добавьте 100 микролитров DMSO в каждую скважину для растворения формазановых кристаллов при низком окружающем освещении.

Поставьте пластину на орбитальный шейкер при 100 оборотах в минуту на 15 минут, защищая её от света. Осмотреть контрольные скважины, чтобы подтвердить полное растворение кристаллов. Поставьте пластину в считыватель микропластин.

Установите опорную длину волны от 630 до 690 нанометров и проверьте поглощение на 570 нанометров. Приготовьте рабочий раствор нейтрального красного цвета объёмом 40 микрограмм на миллилитр в безсывороточном DMEM. Затем приготовьте нейтральный красный раствор десорбции, содержащий 1% ледниковой уксусной кислоты, 49% этанола и 50% ультрачистой воды по объёму.

После оценки эффекта соединения 6 на клетки Vero и HEPG2 удалите среду и добавьте в каждую скважину 100 микролитров фильтрованного нейтрального рабочего раствора красного цвета. Инкубировать тарелку в течение двух часов при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа. После удаления нейтрального красного рабочего раствора промывайте каждую глубинку по одному разу 150 микролитрами стерильного PBS.

Добавьте 150 микролитров нейтрального красного десорбционного раствора в каждую яму. Поставьте пластину на орбитальный шейкер при 150 об/мин на 15 минут, чтобы извлечь краситель. Проверьте контрольные скважины, чтобы подтвердить полное извлечение красителя.

Измеряйте поглощение на 540 нанометров с помощью считывателя микропластин. Хроматограмма ВЭЖХ показала, что Соединение 6 имело время удержания 14,11 минут и чистоту 99%. Спектр ЯМР-протона показал характерные сигналы для пиперидиновой части в диапазоне от 1,50 до 3,13 частей на миллион. Метилсинглет с коэффициентом 2,38 частей на миллион.

И ароматические сигналы, включая дублеты с частотой 6,97 и 7,17 частей на миллион, а также мультиплет с частотой 7,63–7,75 частей на миллион. Спектр ЯМР-спектра углерода-13 показал сигнал метилуглерода с частотой 23,81 части на миллион, а сигналы, связанные с пиперидином, — от 24,85 до 49,70 частей на миллион. Пластина MTT показала чёткий цветовой градиент между концентрациями соединений, что указывает на то, что цитотоксичность была наивысшей при высоких концентрациях соединений с полупрозрачными скважинами и минимальной при низких концентрациях соединений с глубокими фиолетовыми скважинами.

Нейтральная красная пластина для всасывания показала чёткий цветовой градиент между концентрациями соединений, что указывает на то, что цитотоксичность была наивысшей при высоких концентрациях соединений с полупрозрачными колодцами и наименьшей при низких концентрациях соединений с глубокими розовыми скважинами. Этот протокол представляет собой конвейер для разработки кандидатов на препараты против туберкулёза на основе фенотипического скрининга. Важно учитывать и оценивать низкую растворимость синтезированных соединений при применении протокола.

Эти исследования могут служить основой для будущих биодоступных, макрофаговых инфекций и in vivo исследований.