Метод адаптации Euglena gracilis к субстратам на основе маниоки для гетеротрофного выращивания

Наши исследования сосредоточены на адаптации новых листьев Euglena gracilis к отходам маниоки, изучении роста, сокращения цианида и производства биомассы, богатой белком. Этот протокол может применяться в устойчивой переработке маниоки, оценке сельскохозяйственных отходов, производстве кормов и недорогих биотехнологических системах. Для начала маркируйте стерильные 500-миллилитровые вентиляционные колбы с типом субстрата как гарри.

Отметьте соответствующую целевую концентрацию на фляге. Маркируйте колбу с указанием идентификации репликации и запланированным условием стерилизации как автоклавированную или неавтоклавную. Поставьте вес на аналитический вес.

После нажатия на таре взвесьте гарри, чтобы он соответствовал итоговому рабочему объёму. Асептически добавьте взвешенный гарри в стерильную колбу объёмом 500 миллилитров, содержащую 300 миллилитров деионизированной или дистиллированной воды. Заново прикрепите вентиляционную крышку к каждой колбе.

Смешивайте каждую суспензию в течение трёх минут, пока смесь не станет гомогенизированной. Если используется магнитное перемешивание, поместите колбу на размешивательную пластину и установите скорость 200G, чтобы образовать неглубокий вихрь без брызг. Дайте суспензии насыпаться без помех в течение 10 минут при 25 градусах Цельсия.

Затяните вентиляционную крышку непосредственно перед ферментацией и прокрутите колбу вручную пять раз, чтобы аккуратно гомогенизировать смесь и снова подвесить осевший материал. Чтобы подготовить дополнительные материалы из продукта из маниоки, маркируйте колбы и взвешивайте субстрат, как было показано ранее, чтобы получить 30 граммов на литр в зависимости от рабочего объёма. Асептически добавьте взвешенный субстрат в стерильную колбу с 300 миллилитрами деионизированной или дистиллированной воды.

Заново прикрепите вентиляционную крышку к каждой колбе. Увлажните и перемешайте подвеску, как было показано ранее. Убедитесь, что фляжки оснащены стерильной газопропускной вентиляционной крышкой, чтобы обеспечить газообмен и минимизировать загрязнение окружающей среды.

Поставьте фляжки вертикально при 25 градусах Цельсия в специально отведённом месте, вдали от прямых солнечных лучей и от интенсивного потока воздуха, и инкубируете их без перемешивания минимум 72 часа. Запишите дату и время начала брожения для каждой колбы и условия. Убедитесь, что каждая колба объемом 500 миллилитров содержит не более 300 миллилитров жидкости после ферментации, чтобы предотвратить выпарение во время стерилизации.

После того как вентилируемая крышка ослаблена до плотного положения пальца, на колбу нанесите индикаторную ленту автоклава. После загрузки колб в лоток, безопасный для автоклава, поставьте лоток в автоклав и выберите жидкий цикл P13. Установите параметры стерилизации на 121 градус Цельсия на 30 минут для жидкой стерилизации.

Запускайте цикл автоклава. После завершения цикла дайте давлению в камере автоклава вернуться к атмосферному и медленно откройте дверь автоклава. Используя термостойкие перчатки, снимите фляжки и дайте им остыть до комнатной температуры.

Остывшие колбы храните на ночь при комнатной температуре перед прививкой. Используйте ферментированную маниоку напрямую без автоклава, чтобы сохранить местные микробные сообщества. Неавтоклавные среды инокулируйте сразу после 72-часового периода ферментации, чтобы минимизировать нежелательное загрязнение окружающей среды.

Поддерживайте равномерное обращение между репликами, используя одинаковые 500-миллилитровые вентиляционные колбы, одинаковый рабочий объём и одинаковую продолжительность брожения для всех условий субстрата. Инокуляция Euglena gracilis в свежую гетеротрофную питательную среду. Инкубировать культуры в полной темноте при 28 градусах Цельсия с непрерывным орбитальным колебанием при 120G, пока культуры не достигнут среднего логарифмического роста.

Используя микроскоп с составным светом в режиме яркого поля, исследуйте культуры при увеличении от 100 до 400 раз и подтвердите активную подвижность, удлинённую морфологию клеток и низкий уровень настойчивости. Исключайте культуры с чрезмерным содержанием клеточного мусора, аномальной морфологией или повышенной настойчивостью перед экспериментами по адаптации. После аккуратной гомогенизации закваски, затянув вентиляционную крышку, покрутите колбы вручную в течение 15 секунд, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек без вызвания чрезмерного напряжения.

С помощью гемоцитометра Нойбауэра определите плотность клеток. После смешивания культуры, покрутив колбу в течение 15 секунд, пипеткой набейте один миллилитр культуры в стерильную микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 миллилитра. Очистите гемоцитометр и накройте шлепку 70% этанолом и дайте гемоцитометру и крышке высохнуть на воздухе.

Пипетте 10 микролитров посева на две сетки гемоцитометра и нанесите крышку на влажный образец. Используя яркую микроскопию с объективом 10x, сфокусируйтесь на сетке и подсчитайте ячейки внутри определённого набора квадратов на большой сетке, применяя стандартные правила границ. Повторите количество ячеек во второй камере и вычислите средние ячейки на миллилитр и плотность ячеек.

Скорректируйте объёмы инокуляции, чтобы получить итоговый инокулюм 5% по объёму во всех экспериментальных средах. Подготовьте отдельные инокулы для каждого лечебного состояния, чтобы поддерживать единую начальную плотность клеток между экспериментальными группами. Добавьте подготовленный E. gracilis inoculum в автоклавные и неавтоклавированные среды маниоки, приготовленные при финальных концентрациях гарри 10, 20 и 30 граммов на литр.

Используйте равные объёмы инокуляции во всех условиях обработки для стандартизации начальной плотности клеток. После затягивания вентиляционной крышки аккуратно покрутите колбу по кругу в течение 15 секунд, чтобы распределить элементы. Инкубировать культуры в полной темноте при 25 градусах Цельсия, чтобы начать гетеротрофный рост.

Минимизировать перемешивание неавтоклавных сред для сохранения структуры местного микробного сообщества и стратификации субстрата. Смешивайте все культуры один раз в день, мягко ручно помещая в течение 15 секунд, чтобы поддерживать контакт между клетками E.gracilisis и подвешенным материалом маниоки. Используя стерильный наконечник пипетки, каждые 48 часов асептически собирайте образцы по одному миллилитру из каждой культуры.

Затяните вентилируемую крышку и аккуратно покрутите колбу для культуры в течение 15 секунд перед отбором проб, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток и взвешенного материала. После переноса аликвота культуры в стерильную микроцентрифугную пробирку объёмом 1,5 миллилитра разбавьте образец деионизированной водой для улучшения визуализации отдельных клеток. Подготовьте микроскопический слайд с влажным монтажом, нанеся 10 микролитров разбавлённого образца на чистый микроскопический стекло и накрыв образец крышкой.

Используя микроскоп с составным светом в режиме яркого поля, изучайте образцы с полным увеличением от 100 до 400 раз и оценивайте подвижность клеток, морфологию и частоту настойчивости как индикаторы статуса адаптации. Каждые семь дней асептически перемещайте 20% объёма по объёму каждой культуры в свежеприготовленную массу маниоки с одинаковой концентрацией гарри и условиями стерилизации. Поддерживайте стабильные объёмы переноса между проходами и повторяйте последовательное проходжение до тех пор, пока культуры не проявят устойчивый рост, устойчивую подвижность и низкую частоту настойчивости в среде маниоки с концентрацией 30 грамм на литр.

После адаптации к маниоке высокой концентрации и сравнительного анализа роста используйте колориметрические полоски для оценки уровня цианида и наблюдения за развитым цветом. После центрифугирования собирайте биомассу для дальнейшего анализа. В условиях полностью тёмного выращивания культуры, выращенные с 30 граммами на литр гарри, демонстрировали более высокий интегрированный рост, чем низкие концентрации.

Более низкие концентрации гарри — от 10 до 20 граммов на литр — показали заметный, но сниженный и более вариативный рост. Более высокие концентрации — 40–50 граммов на литр — достигали максимальной плотности клеток, но демонстрировали задержку стабилизации и большую вариабельность. Тесты на исключение трипана синего показали, что культуры, поддерживаемые при 30 граммах на литр, сохраняли высокую жизнеспособность на протяжении выбранных временных периодов.

Более высокие концентрации гарри демонстрировали временное снижение жизнеспособности, за которым следовало частичное восстановление с увеличением вариабельности со временем. Положительные результаты включали округлые или полунастаиваемые клетки с пониженной подвижностью, которые сохранялись при повторной субкультурации. Адаптированные культуры E. gracilis демонстрировали воспроизводимый рост на различных типах субстратов и демонстрировали более раннюю стабилизацию с уменьшенным снижением на поздних стадиях по сравнению с культурами дикого типа.

Успешная реализация протокола дала биомассу E.gracilis с измеряемым содержанием сырого белка, количественно оцененным с помощью внешнего лабораторного анализа с использованием метода сгорания Дюма. Проценты белков, наблюдаемые в адаптированных культурах, были сопоставимы с теми, что измерялись в диких культурах с более высоким общим выбросом белка, что соответствует увеличению накопления биомассы. Этот протокол позволяет исследователям изучать рост Euglena, восстановление цианида, производство биомассы и питательный потенциал в различных средах, основанных на маниоке.

Критической задачей в этом протоколе является поддержание стабильной температуры, стабильных условий культуры и сбалансированного микробного сообщества для роста Euglena. Будущие исследования смогут оптимизировать и масштабировать этот протокол, повысить урожайность белка и протестировать различные промышленные применения с использованием различных потоков отходов маниоки в больших масштабах.