Целевые Экспрессия GFP в волосяной фолликул Использование Ex Vivo Вирусный трансдукция
17 марта 2008 г.
Волосяной фолликул является очень сложной придаток кожи содержащих множество типов клеток. Фолликул подвергается постоянным велосипеде через жизнедеятельности организма, включая рост и резорбции с ростом зависимости от конкретных стволовых клеток. Адресности фолликула генами и стволовых клеток, чтобы изменить его свойства, в частности, характер волоса есть, обсуждается. Волосы системы фолликула доставки описаны, например, липосомы и вирусных векторов для генной терапии. Характер волосковых клеток фолликула стволовых обсуждается, в частности, его плюрипотентности.
Волосяной фолликул представляет собой сложный кожный придаток, состоящий из шести концентрических цилиндров с несколькими различными типами клеток, которые вырабатывают высокоспециализированные белки. Непрерывный цикл развития волосяного фолликула через определенные стадии роста делает этот придаток подходящим для таргетной генной терапии, которая потенциально может исправить облысение и потерю пигментации волос. В данном видео мы демонстрируем метод гистокультуры волос и кожи, а также эксвиво-трансдукцию волосяных фолликулов зеленым флуоресцентным белком.
Этот эффективный метод трансдукции полезен для отслеживания активности промоторов различных интересующих генов в разных областях фолликула на протяжении всего цикла его роста. Меня зовут Роберт Хофман. Я президент компании Anti-Cancer Inc.
Сегодня мы продемонстрируем вам высокоэффективные процедуры генной терапии волосяных фолликулов. Данный протокол начинается с гистокультивирования кожи с последующей обработкой коллагеназой. Сначала проводят эвтаназию мышей через шесть дней после деплеции, после чего удаляют кожу спины на уровне подкожной клетчатки.
После удаления кожи удаляют подкожную клетчатку. Затем кожу промывают в PBS без кальция и магния. После промывания в PBS выделенную кожу переносят в среду.
Образцы кожи разрезают на мелкие фрагменты размером примерно один миллиметр в кубе. Часть образцов откладывают и культивируют в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки в качестве необработанного контроля. Остальные образцы инкубируют в концентрации two mg per mil.
Раствор коллагеназы. Образцы инкубируют в среде RPMI в течение от 45 минут до 3,75 часов при 37 °C для переваривания, после чего промывают в PBS без кальция и магния; затем гистокультуры можно инфицировать вирусом для GFP-трансдукции. Коллагеназа сделала волосяные фолликулы более доступными для вируса с целью их индукции.
Для экспрессии GFP сначала проводят инфицирование вирусом аденовируса. Затем к коже, обработанной коллагеназой, добавляют плазмиду с GFP. Гистологические культуры содержат от 2,4 миллиона до 5 миллиардов единиц платформирования на мл.
После добавления вируса гистокультуры кожи помещают в инкубатор на период от одного до шести часов для трансдукции GFP; примерно через 24 часа после сбора образцы можно трансплантировать мышам линии nude или C 57 black six. Затем экспрессию GFP можно оценить с помощью флуоресцентной микроскопии, выполняемой либо на гистокультурах, либо путем визуализации in vivo на трансплантированной коже. Для определения эффективности трансдукции GFP с помощью микроскопии в светлом поле и флуоресцентной микроскопии определяют общее количество волосяных фолликулов и количество GFP-положительных волосяных фолликулов.
Анализируют пять случайно выбранных полей зрения микроскопа, охватывающих площадь 0,581 мм². Для оценки экспрессии GFP подсчитывают не менее 500 волос на один образец, чтобы определить процент GFP-положительных волосяных фолликулов. Волосяные фолликулы, в которых GFP визуализируется в любой части волосяной луковицы или стержня волоса, считаются GFP-положительными.
Мы только что продемонстрировали высокоэффективный метод трансдукции GFP в волосяные фолликулы, который будет чрезвычайно полезен для генной терапии. Эти знания имеют клиническое значение, поскольку они могут быть применены для лечения алопеции или облысения, предотвращения алопеции, вызванной химиотерапией, и постоянного изменения цвета волос. Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.
Обзор
Волосяной фолликул представляет собой сложный придаток кожи, который проходит через непрерывные циклы развития, что делает его мишенью для генной терапии. В данной статье рассматриваются методы гистокультивирования и трансдукции генов в волосяных фолликулах, что может иметь значение для лечения облысения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Генная терапия
- Дерматология
Теоретическая часть
- Волосяные фолликулы состоят из множества типов клеток и структур.
- Они проходят через циклы стадий роста под влиянием стволовых клеток.
- Генная терапия потенциально может помочь при таких состояниях, как облысение.
- Понимание биологии волосяного фолликула имеет решающее значение для разработки эффективных методов лечения.
Цель исследования
- Продемонстрировать метод гистокультивирования волосяных фолликулов.
- Изучить методы трансдукции генов в волосяных фолликулах.
- Оценить эффективность экспрессии GFP в волосяных фолликулах.
Используемые методы
- Гистокультивирование образцов кожи с последующей обработкой коллагеназой.
- Инфицирование волосяных фолликулов аденовирусом, несущим плазмиду GFP.
- Оценка экспрессии GFP с помощью флуоресцентной микроскопии.
- Анализ эффективности трансдукции путем подсчета GFP-положительных волосяных фолликулов.
Основные результаты
- Была достигнута эффективная трансдукция волосяных фолликулов с помощью GFP.
- Экспрессию GFP можно визуализировать in vivo и в гистокультурах.
- Метод демонстрирует потенциал для применения в генной терапии.
- Обсуждались возможности применения метода для лечения алопеции и изменения цвета волос.
Выводы
- В исследовании представлен эффективный метод генной терапии волосяных фолликулов.
- Понимание механизмов трансдукции генов может способствовать прогрессу в лечении облысения.
- Будущие исследования могут быть сосредоточены на клиническом применении данных методов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Целевая вирусная трансдукция волосяных фолликулов ex vivo обеспечивает точную доставку генов в отдельные популяции фолликулярных клеток, что позволяет функционально исследовать экспрессию генов в сложной регенерирующей ткани. Данный подход повышает прогностическую достоверность стратегий генной терапии в рамках разработок в области дерматологии и регенеративной медицины, особенно в тех случаях, когда критически важны специфичность к типу клеток и количественная эффективность трансдукции. Количественные показатели и воспроизводимость данного метода делают его ценным инструментом для валидации мишеней на ранних этапах и трансляционных исследований в биофармацевтических разработках.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает функциональную валидацию генных мишеней в определенных популяциях клеток волосяного фолликула.
- Помогает снизить механистические риски, позволяя осуществлять пространственный и временной мониторинг экспрессии генов с помощью GFP.
- Облегчает количественную оценку активности промотора и эффективности доставки генов.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает воспроизводимую систему ex vivo для оценки векторов и конструкций по доставке генов.
- Позволяет получать стандартизированные, количественно измеримые данные об эффективности трансдукции с помощью флуоресцентной микроскопии.
- Служит базой для разработки методов скрининга кандидатов для генной терапии, направленной на биологию кожи и волосяных фолликулов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует биологическим системам, релевантным для моделирования заболеваний волосяных фолликулов и разработки методов регенеративной терапии.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя проводить трансплантацию in vivo и лонгитюдный мониторинг экспрессии генов.
- Помогает принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем развитии программ генной терапии, направленных на придатки кожи.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вирусной трансдукции ex vivo интегрируется в континуум от поиска до доклинических исследований, связывая валидацию in vitro и функциональную оценку in vivo для кандидатов на генную терапию, нацеленных на биологию волосяного фолликула.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей, позволяя проводить направленный анализ экспрессии генов в субпопуляциях волосяных фолликулов.
- Скрининг: предоставляет количественные, воспроизводимые данные об эффективности трансдукции для обоснованного выбора вектора и конструкции.
- Аналитика: обеспечивает надежные измерения на основе флуоресценции для сравнения условий и результатов доставки генов.
- Трансляционные исследования: способствует обеспечению преклинической преемственности посредством трансплантации и мониторинга генно-модифицированных фолликулов in vivo.
- Корпоративное повторное использование: предлагает масштабируемую и адаптивную платформу для оценки различных методов генной терапии на моделях кожи и волосяных фолликулов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность в валидации мишеней для генной терапии и снижает механистическую неопределенность в сложных тканях.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы доставки и количественного определения генов для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и приоритизацию портфеля за счет предоставления количественных данных о трансдукции с привязкой к конкретным типам клеток.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию активов генной терапии для дерматологических и регенеративных показаний с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами тканей ex vivo, вирусными векторами и флуоресцентной микроскопией.
- Необходим доступ к аналитической инфраструктуре для количественного получения изображений и анализа данных.
- Для обеспечения воспроизводимости необходима межкомандная стандартизация процессов обработки тканей и критериев оценки.
- Может потребоваться адаптация метода для разных видов, типов волосяных фолликулов или векторов доставки генов.
- Эффективность и специфичность могут варьироваться в зависимости от типа вектора, выбора промотора и состояния ткани.
