Оценка влияния покрытых фильтров и префильтров на инфекционность и концентрацию аэрозольного вируса Phi6

Мы исследуем влияние предварительных фильтров и противовирусных покрытий на снижение воздушно-капельной инфекции вирусов и концентрации в помещениях. Современные подходы упускают реалистичную динамику воздушного потока. Наш протокол воссоздаёт аэрозольные условия и измеряет как инфекционные вирусы, так и общую вирусную нагрузку.

Для начала разведите очищенную суспензию бактериофагов phi6 в 20-миллимолярном буфере фосфата калия, содержащем один миллимолярный хлорид магния, отрегулированный до pH 7,2. Соберите все материалы фильтра, предварительного фильтра и противовирусных покрытий внутри биобезопасности для проведения поверхностных тестов. Оценить противовирусную активность всех материалов покрытия на основе меди или активных компонентов меди и серебра, встроенных в проприетарные матрицы, а именно A6, B4, VS и VS B, на плоских тестовых изделиях.

Далее пипетка 20 микролитров разбавленной раствора бактериофага phi6 на покрытые тестовые изделия для проведения анализа жизнеспособности поверхности. Равномерно распределите образец по площади два на два сантиметра с помощью стерильного стеклянного треугольника. Инкубировать образцы при 22 градусах Цельсия до четырёх точек времени, включая одну минуту, пять минут, час или три часа.

Добавьте 180 микролитров свежего LB бульона на поверхность, чтобы восстановить вирусы после каждой временной точки. Промыйте поверхность, повторяя пипетирование 10–20 раз для сбора образца. Используйте пластиковую чашу Петри в качестве контрольной поверхности.

Количественно оценить противовирусную эффективность поверхностных покрытий с помощью анализа бляшек для измерения количества инфекционных вирусных частиц и количественной обратной транскриптазной полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) для определения количества копий вирусного генома. Разбавить очищенную и концентрированную суспензию бактериофага фи6, как было показано ранее, чтобы получить концентрацию вируса в диапазоне от 2,5 умножить на 10 до степени 10 и 4,08 умножить на 10 до мощности 11 единиц образования бляшек на миллилитр. Далее собрать экспериментальную аэрозольную камеру с использованием цилиндрического стеклянного корпуса с подходящей крышкой.

Вставьте внутренние металлические каркас в камеру и закрепите изоляционные прокладки для герметичности. Используйте небулайзер в сочетании с воздушным насосом для стабильного и воспроизводимого подачи вирусных аэрозолей. Титруйте раствор вируса, используемый в небулайзере, до и после каждого эксперимента, чтобы контролировать стабильность.

Установите расход аэрозоля в камере на восемь литров в минуту. Для снижения влажности при длительных измерениях направляйте примерно три четверти потока аэрозоля в выхлопные газы через высокоэффективный фильтр для твердых частиц воздуха (HEPA). Позвольте оставшейся четверти потока, соответствующей двум литрам в минуту, попасть в камеру.

Используйте воронку, чтобы направить поток аэрозоля к фильтру или поверхности предварительного фильтра внутри камеры. Осушите исходящий поток воздуха с помощью осушителя, чтобы защитить HEPA-фильтр и измеритель расхода от избыточной влажности. Используя внешний насос, создайте отрицательное давление внутри системы и дополнительно поддерживайте поток воздуха для обеспечения эффективного отвода через выходной отверстие.

Оцените противовирусные свойства непокрытых или VS B-покрытых полиэстеровых и бульпреновых предфильтров наряду с двухслойными стекловолокнистыми материалами внутри аэрозольной камеры. Для оценки противовирусного эффекта с помощью пробного отбора проб разместите чашку Петри с буфером HEPES 20 миллимоляров при pH 7,2 непосредственно под тестовым предфильтром, чтобы максимизировать отложение частиц. В качестве альтернативы, чтобы проверить противовирусный эффект фильтров GF2, установите тройной стеклянный вихревый импингер, подключённый к внешнему насосу для сбора аэрозолей.

Поддерживайте поток воздуха через тестовый предфильтр или фильтр на скорости два литра в минуту. Увеличите общий приток воздуха до 10 литров в минуту с помощью дополнительного клапана после выхода из камеры. Захватите аэрозоли в пять миллилитров 20-миллимолярного буфера HEPES.

И пополняйте испаренный буфер каждые 30 минут. Для тройного отбора проб проводите контрольные запуски без предварительных фильтров в течение 15 минут до и после каждого эксперимента. После предварительного контроля перед экспериментом вставьте фильтр или предварительный фильтр в камеру и управляйте системой в течение трёх часов.

Собирайте вирусные аэрозоли, извлекая один миллилитр суспензии из чашок Петри с 20 миллилитрами буфера каждые 30 минут. Снимите фильтр и проведите контрольный запуск после эксперимента. Собирайте образцы каждые 30 минут во время эксперимента, чтобы получить по восемь образцов qRT-PCR и титрирования на каждый эксперимент.

В экспериментах с импингером титрирование собирают только один раз в конце трёхчасового запуска. Используйте 800 микролитров собранного образца для анализа qRT-PCR и оставшиеся 200 микролитров для титрации вирусов. Мгновенно заморозьте образцы qRT-PCR в жидком азоте и храните их при 80 градусах Цельсия.

Немедленно обработайте образцы титрации вируса с помощью анализа бляшек. Анализы жизнеспособности поверхности показали, что все протестированные покрытия успешно инактивировали вирус, при этом значительное снижение было зафиксировано в первые пять минут. Поверхностное покрытие на основе меди B4 достигло наилучшего снижения, снизив количество инфекций на три порядка за пять минут и достигнув полной инактивации с пределом обнаружения менее 100 единиц образования бляшек на миллилитр на 15 минут.

Покрытие A6 обеспечивало полную инактивацию вируса за 25 минут, а VS B — за 60 минут. Покрытие VS показало самую медленную скорость инактивации среди исследуемых материалов. Изученные предфильтры BP6, S11 и FMR5 были одинаково эффективны в снижении количества инфекционных вирусов, проходя через них на 1,5–2 порядка по сравнению с контролем без фильтра.

Фильтры GF2 продемонстрировали превосходную эффективность, снизив вирусную нагрузку как минимум на шесть порядков, и в пределах установленного предела не было обнаружено инфекционных бляшек вируса phi6. Покрытие VS B существенно не повлияло на эффективность фильтрации инфекционных вирусов по сравнению с непокрытыми предфильтрами. Результаты qRT-PCR показали, что предварительные фильтры снижают количество копий вирусного генома до двух порядков.

Фильтр GF2 показал уменьшение до четырёх порядков по сравнению с контролем без фильтра. Хотя различия между предвариальными фильтрами и контролем оставались незначительными в первые 30 минут, эффективность механической фильтрации увеличилась по сравнению с 60-минутным временем. Кроме того, нанесение покрытия VS B не имело измеримого влияния на количество вирусных геномов, проходящих через фильтрационную среду.

Этот протокол позволяет исследователям количественно оценивать инактивацию вируса, эффективность фильтрации и различия между инфекционными частицами и общей вирусной нагрузкой. Ключевая проблема — очень короткое время контакта с поверхностью вируса во время воздушного потока, что ограничивает эффективность противовирусных покрытий. Будущие исследования могут исследовать сочетание покрытий с УФ-излучением или тестирование производительности в реальных вентиляционных системах и с различными вирусами.