Эндогенное флуоресцентное метирование генов, специфичных для зародышевой линии, опосредованное CRISPR/Cas9 у Caenorhabditis elegans

Мы используем эндогенную маркировку на основе CRISPR для изучения локализации и динамики зародышевых белков у C. elegans. Традиционные трансгены могут влиять на экспрессию зародышевой линии, но этот протокол помечает белки в эндогенном локусе под нативным контролем. Для начала идентифицируйте кандидатные гены с преобладающей экспрессией в гонады или герминальных клетках с помощью публичных баз данных и опубликованной литературы.

После открытия записи UniProt для целевого белка нажмите «Структура», чтобы оценить структурные особенности и домены белка и определить подходящий сайт флуоресцентной маркировки. Прокрутите вниз и откройте запись AlphaFold DB, чтобы проверить значения доверия модели. Нажмите на раздел «Домены» для конкретных структурных классификаций.

Далее откройте страницу целевого гена в WormBase. Прокрутите вниз и нажмите на виджет Sequences и основную ссылку на расшифровку, чтобы открыть страницу транскрипта. Прокрутите вниз до раздела «Последовательности» и нажмите на конкретную опцию, чтобы показать склеенную последовательность выбранной транскрипции.

На веб-странице IDT CRISPA-Cas9 Guide RNA Design Tool скопируйте и вставьте первую экзонную последовательность целевого гена со страницы WormBase и выберите C, elegans из выпадающего меню Species для проектирования направляющей РНК или gRNA. Нажмите кнопку DESIGN, чтобы получить и просмотреть наиболее рекомендуемую последовательность gRNA и соответствующую последовательность PAM. На SnapGene выберите Sequence, чтобы определить точку клонирования между промотором CeU6 и областями каркасов gRNA.

Скопируйте последовательность gRNA со страницы инструмента IDT, вставьте её в диалоговое окно вставки и нажмите «Вставить», чтобы интегрировать проставку в плазмид экспрессии CRISPR. Чтобы подтвердить точность вставки gRNA, выберите последовательность и нажмите «Показать выравнивания», чтобы сравнить результаты секвенирования Сэнгера по основанию с ожидаемой последовательностью. Для создания донорской плазмиды скопируйте геномные последовательности гомологического отдела из WormBase.

В SnapGene вставьте последовательность и нажмите Вставить. Далее кликните правой кнопкой мыши по месту вставки, чтобы открыть окно «Задать цвет ДНК» и измените его на Оранжевый, чтобы отметить соединение. Скопируйте последовательность вставки зелёного флуоресцентного белка или GFP и вставьте её прямо в отмеченную позицию.

Затем нажмите «Добавить функцию». Назовите функцию GFP. Измените цвет дисплея на зелёный и нажмите OK, чтобы завершить сборку плазмиды донора в силико.

Чтобы ввести тихую замену в шаблон донорской плазмиды и предотвратить повторное сечение Cas9 после интеграции, скопируйте 19-нуклеотидный гРНК-спейсер из экспрессионного вектора. Во вкладке донорской плазмиды вставьте последовательность в строку поиска последовательности ДНК, чтобы найти целевой участок и выбрать конкретное положение нуклеотида для мутации. В разделе «Заменить основание» введите новый нуклеотид и нажмите «Вставить».

Кликните правой кнопкой мыши по изменённой базе и используйте Set DNA Color, чтобы изменить цвет на красный. Согласовать результаты секвенирования донорской плазмиды Сэнгера с ожидаемой последовательностью для подтверждения целостности. Приготовьте инъекционную смесь, объединив плазмиду экспрессии CRISPR, донорскую плазмиду и маркеры совместной инъекции в стерильной двойной дистиллированной воде до конечного объёма 10 микролитров при указанной концентрации.

Затем центрифугуйте смесь при 10 000 г в течение 10–20 минут, чтобы выделить частицы и предотвратить закупорку микроинжекционного капилляра. Используйте вытягивающий иголку, чтобы создать микроинъекционные иглы из стеклянных капилляров с длинным конусом и острым концем, подходящие для гонадальных инъекций, при этом эмпирически оптимизируя полярные настройки. Нагрейте микрокапиллярную пипетку и разломите её на две части, чтобы создать инструмент для загрузки.

Прикрепите резиновую лампу аспиратора к широкому концу укороченной микрокапиллярной пипетки. Впитывайте примерно один микролитр инжекционной смеси в загрузчик. Вставьте загрузчик в заднюю часть иглы и аккуратно раздайте смесь для инъекций.

Положите загруженную иглу горизонтально на 10 минут, чтобы образовать непрерывную колонну и дать раствору оседать к кончику. Установите иглу на инъекционный микроскоп и приведите кончик в фокус с помощью яркополевой оптики. Откройте кончик иглы, аккуратно касаясь края крышки в галокарбоновой масле и проверьте поток.

Для выращивания червей для инъекций держите червей типа N2 на средних пластинах с бактериями OP50. Отбирайте гермафродитов на стадии L4 из здоровой пластины и инкубируют при 20 градусах Цельсия в течение 10 часов, чтобы получить молодых взрослых с хорошо развитыми зародышевой линиями. Перенесите червей на незасеянную пластину, чтобы уменьшить перенос бактерий.

Подготовьте сухую подушку 2% агарозы на стеклянном стекле. И нанесите каплю галоуглеродного масла. Используйте щипку ресниц, чтобы перенести червя на агарозную подушечку и обездвижить его.

Используйте прицел с низким увеличением, чтобы ориентировать гонаду для инъекции. Используйте микроманипулятор, чтобы расположить иглу под углом 20–40 градусов относительно червяка. Используйте большое увеличение для фокусировки на дистальной зародышевой линии.

Переместите червя на иглу и разместите кончик внутри гонадального синцития. Вводите раствор, пока гонада не набухнет. Вынимите иглу и переместите её для последующих инъекций.

Добавьте буфер M9 для смягчения и частичного разрушения агарозной подушечки, чтобы выпустить червей. Перенесите каждого червя на отдельную пластину для восстановления. Затем повторяйте инъекции на 20–25 червей.

Проводите скрининг потомства F1 на коинъекционные маркеры и выбирайте животных, положительных к маркерам. Переложите каждого червя F1 на отдельную тарелку и дайте откладку яиц на один-два дня. Лизируйте каждого червя F1 в буфере протеиназы K для подготовки ПЦР-шаблонов.

Проведите ПЦР с переходом с использованием одного геномного праймера вне гомологического рукава и одного внутреннего праймера с меткой. И сохранять соответствующие пластинки от животных с ПЦР-положительным F1. Изолировать потомство F2 из ПЦР-положительных линий F1 на отдельные пластины для получения потомства.

Взрослые лица для генотипирования. Проведите ПЦР с использованием праймеров, расположенных по бокам гомологических рукавов, чтобы различать аллели дикого типа и knock-in по размеру продукта. Используйте инструмент SnapGene для проверки и валидации правильной интеграции как в левом, так и в правом вставлении, выравнивая результаты секвенирования Сэнгера с ожидаемой отредактированной геномной последовательностью.

Используйте флуоресцентную микроскопию для проверки экспрессии и локализации зародышевой линии. Расширить подтверждённые гомозиготные линии. Поддерживайте запасы и криосохраняйте валидированные линии для долгосрочного хранения.

ПЦР-скрининг потомков F1 выявил успешные knock-in, выявленные 1 550-парным ПЦР-ампликоном с соединением с использованием одного фланкирующего геномного и одного внутреннего GFP-праймера. Отсутствие полосы из 1 550 пар оснований у большинства животных F1 указывало на отсутствие обнаруживаемой интеграции мишеней, что соответствует неинтегративной передаче ДНК, а не гомологически ориентированному ремонту. Определение зиготности у потомков F2, полученных из ПЦР-положительных линий соединения, различает аллели по размеру полос — 1, 345 пар оснований как аллель дикого типа, и 2 344 пары оснований как аллель knock-in.

Гетерозиготы показывают обе группы. Гомозиготные knock-in сэмплы не имеют диапазона размера дикого шрифта, а сэмплы с неудачной интеграцией показывают только продукт размера дикого шрифта. Дополнительная валидация гомозиготной линии GFP knock-in была проведена с помощью конфокальной микроскопической визуализации, где наблюдалась флуоресценция GFP в клетках зародышевой линии с сигналом, обогащённым в сперматогенной области.

Этот протокол позволяет in vivo анализировать локализацию белка и динамику в зародышевой линии C.elegans. Тщательное проектирование меток и тщательная валидация необходимы для сохранения функции белка и минимизации ложноположительных кандидатов. Будущие исследования смогут использовать этот рабочий процесс для отслеживания локализации белков и изучения возможных взаимодействий в процессе развития зародышевой линии.