Визуализация и количественная оценка межмолекулярного парирования баз РНК in vitro кластеров РНК с использованием репортеров РНК с разделёнными брокколи
May 29th, 2026
Этот протокол описывает визуальный анализ с использованием разделённых РНК-репортеров брокколи для обнаружения и количественной оценки межмолекулярного спарения основ в кластерах РНК in vitro.
Мы применяем репортерный анализ РНК на разделённой брокколи для обнаружения и количественной оценки межмолекулярного спарения оснований в РНК-кластерах in vitro. Химические исследования и симуляции указывают на взаимодействия РНК, но не могут их напрямую измерить. Этот протокол позволяет проводить прямую и точную оценку внутри РНК-кластеров.
После подготовки ДНК-шаблонов для in vitro транскрипции РНК протрите рабочую поверхность, стойки для трубок и пипетки раствором для дезактивации рибонуклеазой. Используйте фильтрованные насадки без рибонуклеазы для всех этапов пипетирования. Разморозить буфер реакции и растворы нуклеотидов, поставляемые в комплекте транскрипции, вместе с уридинтрифосфатом цианином 5, или UTP-Cy5, на льду.
Центрифугуйте все трубки при 2 000 г в течение двух секунд перед использованием. Затем вычислите количество основ тимина в ДНК. Определить необходимые объемы UTP и UTP-Cy5 для транскрипционной реакции объёмом 20 микролитров, сохраняя при этом единую плотность маркировки для всех видов РНК.
Далее подготовьте транскрипционную реакцию объемом 20 микролитров, объединив представленные реагенты. Тщательно перемешайте, поднимая и опуская пипе, и центрифугуйте при 2 000 г в течение двух секунд. После инкубации реакции при 37 градусах Цельсия в течение шести часов добавьте один микролитр дезоксирибонуклеазы, поставляемой в комплекте, тщательно перемешайте пипеткой и снова центрифугайте.
Затем инкубировать при 37 градусах Цельсия ещё 15 минут. Перенесите реакцию в трубку объёмом 1,5 миллилитра. Добавьте 115 микролитров воды без нуклеазы и 15 микролитров раствора аммоний-ацетата, который поставляется в комплекте.
После смешивания центрифугуйте раствор при температуре 2 000 г в течение двух секунд. Затем добавьте 150 микролитров фенолхлороформ в пробирку и аккуратно перемешайте, чтобы соединить фазы. Центрифугу при 16 000 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.
Затем переведите верхнюю водную фазу в новую трубку. Добавьте равный объём хлороформ в перенесённый раствор и тщательно перемешайте для правильного взаимодействия между фазами. Теперь центрифугуйте при 16 000 г в течение двух минут при 4 градусах Цельсия и повторите процесс фазового разделения ещё раз.
Затем перенесите водный слой примерно 100–150 микролитров в новую трубку. Добавьте 900 микролитров изопропанола и тщательно перемешайте. После алицитирования раствора в отдельных пробирках храните образцы при минус 20 градусах Цельсия на ночь или до месяца.
Центрифугуйте образец РНК в изопропаноле при 16 000 г в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия. Аккуратно удаляйте изопропанол, не нарушая РНК-гранулу. Затем добавьте в гранулу один миллилитр 70% этанола, приготовленного в воде без нуклеазы.
Центрифуга при 16 000 г в течение двух минут при 4 градусах Цельсия. После удаления этанола добавьте в трубку один миллилитр 70%этанола, приготовленного в воде без нуклеаз, и повторите центрифугирование. Во время финальной промывки этанолом удалите большую часть этанола с помощью пипетки объемом 1 000 микролитров.
Кратко центрифугуйте при 2 000 г в течение двух секунд в настольной мини-центрифуге и удалите оставшийся этанол с помощью 20-микролитровой пипетки. После высыхания РНК-гранулы восстановите её в 20 микролитрах воды без нуклеаз. Держите образец на льду и защищайте его от света.
С помощью микрообъёмного спектрофотометра измеряйте концентрацию и чистоту РНК. Убедитесь, что коэффициент поглощения при 260 на 280 нанометрах примерно равен 2,0, а коэффициент при 260 на 230 нанометрах — больше 2,0. Разморозить пробирку раствора спермина 100 миллимоляров и 50% полиэтиленгликоля 8 000 на льду.
Свежо подготовьте буфер для перескладывания РНК 10X, объединив показанные компоненты. После тщательного смешивания компонентов с помощью пипета центрифугуйте при 2 000 г в настольную мини-центрифугу на две секунды. Для условия ко-сворачивания в ПЦР-трубке объемом 200 микролитров сочетайте in vitro транскрипционированную РНК с верхней или нижней последовательностью, буфер для сворачивания РНК и воду без нуклеазы.
Тщательно перемешивайте, проводя пипеной вверх-вниз и центрифугой, как было показано ранее. Нагрейте образец при 90 градусах Цельсия в течение двух минут. Немедленно переведите образец до комнатной температуры.
Защитите от света и инкубуйте в течение одного часа. Для отдельного сгибания нагрейте образец РНК в ПЦР-пробирке объемом 200 микролитров, а затем сразу поставьте его на лёд минимум на 15 минут. В ПЦР-пробирке объемом 200 микролитров объединяйте in vitro транскрибированную РНК, несущую либо верхнюю, либо нижнюю последовательность, 10-кратный буфер для сворачивания РНК и воду без нуклеазы.
Инкубировать реакцию при комнатной температуре в течение 30 минут, защищая от света. Теперь объедините образцы РНК с верхней и нижней последовательностями в одну ПЦР-пробирку и тщательно перемешайте, пробирая вверх и вниз. Центрифугу при 2 000 г в течение двух секунд в настольной мини-центрифугах.
Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Для обоих состояний добавьте шесть микролитров премикса 100 миллимолярных спермина и 50% полиэтиленгликоля 8 000. После смешивания центрифугите при 2 000 г в настольную мини-центрифугу на две секунды.
Теперь смешайте два микролитра одного миллимолярного DFHBI-1T с реакцией и снова центрифугайте. Загрузите реакцию в стеклянное стекло с крышкой. Инкубировать камеру при комнатной температуре в течение четырёх часов в темноте с крышкой, чтобы минимизировать испарение.
Загрузите стекло в стеклянной камере на ступень микроскопа. Включите лазер, затем используйте окуляри, чтобы найти и сфокусироваться на образце. Настройте микроскоп так, чтобы каждый интересующий участок сначала показал цианиновый 5-канал на каждой плоскости Z.
Затем сфотографируйте тот же интересующий регион с помощью зелёного флуоресцентного белкового канала. Установите время экспозиции на 500 миллисекунд для всех каналов. Затем установите мощность лазера на 80% для зелёного флуоресцентного белкового канала и 40% для цианинового 5-канала.
Используя Z-шаг размером 150 нанометров, сфотографируйте область скольжения крышки вне реакционной капли при комнатной температуре. Затем количественно измерите межмолекулярные пары оснований с помощью программного обеспечения для анализа изображений. При индукции кластеризации РНК обе РНК образовывали кластеры по отдельности или вместе.
Флуоресценция DFHBI-1T внутри РНК-кластеров была значительно ниже только для верхних или нижних РНК по сравнению с условием совместного сворачивания. В отдельном условии сгибания нормализованный сигнал DFHBI-1T составлял 0,031, что сопоставимо с базовыми уровнями, наблюдаемыми только сверху или снизу. Шу-топ, шу-боттом, шу-анти-топ и шу-анти-боттом по отдельности демонстрировали минимальную флуоресценцию DFHBI-1T.
Совместное складывание shu-top с shu-bottom или shu-anti-top с shu-anti-bottom обеспечивало более высокий сигнал DFHBI-1T, чем отдельное складывание. Совместное сворачивание шу-топа и шу-боттома привело к 5,63-кратному увеличению нормированной флуоресценции DFHBI-1T. Отдельное складывание shu-top и shu-bottom показало увеличение всего в 1,04 раза, сопоставимого с базовыми уровнями.
Shu-top, смешанный с shu-anti-bottom и shu-anti-top, смешанный с shu-bottom, демонстрировал более высокую флуоресценцию DFHBI-1T, чем пары одинаковой ориентации при обоих условиях складывания. Совместное сгибание шу-топа с шу-анти-боттом и шу-анти-топом с шу-боттом привело к 61,86 и 82,60-кратному увеличению флуоресценции DFHBI-1T соответственно. Отдельное складывание этих смешанных пар дало меньшие увеличения — 2,69 и 4,94 раза соответственно.
Самый важный момент заключается в том, что устойчивая генерация сигнала может потребовать реагентов с переполненностью, тогда как чувствительность зависит от эффективной димеризации и сгибания РНК расщеплённых брокколи. Этот анализ дополняет подходы РНК pull down и гель-электрофорез для изучения межмолекулярных пар оснований в РНК-кластерах. Этот анализ позволяет изучать влияние РНК-последовательностей, геликаз и ионов на межмолекулярное спаривание оснований внутри РНК-кластеров.
Overview
This article presents a protocol for directly detecting and quantifying intermolecular base pairing in RNA clusters in vitro using a split Broccoli RNA reporter assay. The method leverages fluorescently labeled RNAs and a split aptamer system to visualize and measure RNA–RNA interactions, providing a quantitative alternative to chemical probing and computational predictions.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- RNA biochemistry
- Fluorescence microscopy
Background
- RNA clustering is driven by multivalent intermolecular RNA–RNA interactions.
- Traditional methods like chemical probing and computational simulations infer but do not directly measure these interactions.
- Direct assessment of intermolecular base pairing within RNA clusters has been limited.
- The split Broccoli RNA aptamer system enables fluorescence-based detection of RNA dimerization.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a visual assay for direct detection of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- To quantify how in vitro clustering conditions affect RNA–RNA interactions.
- To provide a complementary approach to existing RNA interaction assays.
Methods Used
- Preparation of DNA templates and in vitro transcription of RNAs labeled with Cy5.
- Purification of transcribed RNAs using phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation.
- Folding of RNAs under co-folding and separate folding conditions with crowding reagents (spermine, PEG 8000).
- Assembly of split Broccoli RNA reporters and addition of DFHBI-1T fluorophore.
- Fluorescence imaging using confocal microscopy and quantitative image analysis.
Main Results
- DFHBI-1T fluorescence was substantially higher in co-folded RNA samples compared to separately folded or single RNA controls.
- Co-folding of complementary split Broccoli RNAs resulted in up to 82.6-fold increases in fluorescence, indicating robust intermolecular base pairing.
- Mixed orientation pairs (shu-top with shu-anti-bottom, etc.) showed the highest fluorescence increases upon co-folding.
- Robust signal generation depended on crowding reagents and efficient RNA dimerization.
Conclusions
- The split Broccoli RNA reporter assay enables direct, quantitative assessment of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- This method complements traditional RNA interaction assays such as pull-downs and gel electrophoresis.
- The assay can be used to study the effects of RNA sequence, helicases, and ions on RNA–RNA interactions in vitro.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Direct quantification of intermolecular RNA base pairing in vitro addresses a critical gap in early discovery, enabling mechanistic de-risking of RNA-driven clustering phenomena. The split Broccoli RNA reporter assay provides a quantitative, fluorescence-based readout for RNA–RNA interactions, supporting predictive confidence in target validation and assay development. This capability enhances portfolio triage by clarifying the molecular basis of RNA clustering under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of RNA–RNA interaction hypotheses within clustered assemblies.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing specific intermolecular base pairing from background association.
- Provides quantitative data to inform target validation and early-stage portfolio decisions.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated RNA cluster systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible fluorescence outputs for assay benchmarking.
- Enables reliable evaluation of sequence, helicase, or ionic effects on RNA–RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant RNA clustering models when mechanistic continuity is required.
- Supports risk-adjusted advancement by providing quantitative, comparative readouts across experimental conditions.
- Offers predictive de-risking for RNA-targeted therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery continuum from hypothesis-driven target validation through assay development and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Quantifies direct intermolecular base pairing, clarifying RNA clustering mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative fluorescence outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables statistical comparison of folding conditions and sequence variants using normalized fluorescence measurements.
- Translational Research: Supports continuity by modeling RNA–RNA interactions relevant to disease or therapeutic context.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse RNA interaction studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA clustering studies.
- Operational Value: Standardizes detection and quantification of RNA–RNA interactions for scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for RNA-targeted assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on direct, quantitative mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biochemistry and fluorescence microscopy.
- Needs access to confocal imaging and quantitative image analysis infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of RNA preparation and folding protocols.
- May require adaptation for different RNA sequences or clustering models.
- Sensitivity depends on efficient dimerization and folding of split Broccoli RNAs and use of crowding reagents.
