Упрощённый протокол для одномолекулярной локализации микроскопии в ядрах арабидопсиса

Мои исследования сосредоточены на редактировании эпигенома и визуализации структуры хроматина в ядрах Arabidopsis с использованием микроскопии с высоким разрешением. Существующие методы не адаптированы для STORM-визуализации. Этот протокол улучшает чистоту ядер, консистентность маркировки, монтаж образца и стабильность визуализации.

Он применяется к Arabidopsis thaliana и другим растительным системам для изучения организации ядер, структуры хроматина и эпигенетики с высоким разрешением. Для начала поставьте пластину с шесть колодцев на лёд под вытяжкой для выпарива. Смешайте фиксационный раствор, содержащий 4% объёма, метанол-стабилизированный формальдегид 0,1%, тритон, X100 и PBS.

Добавьте примерно четыре миллилитра раствора для холодной фиксации в каждую яме под вытяжкой. Используя чистые щипцы, удаляйте саженцы Arabidopsis, которые находятся в период от восьми до пятнадцати дней после прорастания, из твердого полукрепкого Murashige и Skoog, или MS medium. Немедленно окуните всходы в раствор фиксации и разместите примерно по 20 саженцев в каждом колодце.

Используйте три скважины, чтобы получить достаточное количество материала на образец. Поместите пластину в вакуумную камеру, заполненную льдом, и закройте её. Примените вакуумное циклирование между минус 0,6 бар и минус 0,8 бар в течение 15 минут, чтобы удалить захваченный воздух и обеспечить глубокое проникновение фиксатора в ткани растений.

Затем медленно отпускайте пылесос. Перемешайте образец и примените вакуум ещё на 15 минут. Под вытяжкой удалите раствор фиксации с помощью пипетки.

Промывайте каждую скважину три раза по 10 минут под мягким перемешиванием с помощью пяти миллилитров ледяного PBS. После стирки снимите PBS. С помощью щипцов перенесите фиксированную ткань в чашку Петри размером 120 на 120 миллиметров и добавьте 50 микролитров буфера для изоляции ядер к фиксированной всадке.

Лезвием нарежьте фиксированную ткань. Тем же лезвием соскребите нарезанную ткань к одному краю чашки Петри. Добавьте 600 микролитров буфера для изоляции ядер и смойте всю ткань, прилипшую к лезвию.

Переложите тканевую суспензию в двухмиллилитровую гомогенизаторную трубку Dounce и проведите от пяти до десяти раз меньшим пестиком. Затем погладьте большим товкачем, пока он плавно не движется внутри трубки, обычно требуя от пяти до десяти ударов. Отфильтруйте гомогенизированный образец через 30-микрометровый сетчатый фильтр в 50-миллилитровую трубку.

Переложите фильтрат в свежую трубку объемом 1,5 миллилитра. Центрифугуйте подвеску на 10 минут при давлении 800G, используя самый низкий наклон для ускорения и торможения. После центрифугирования обратите внимание, что среди зелёных тканевых остатков видна небольшая белая гранула.

Сбросьте супернатант и снова суспензируйте гранулу в 600 микролитрах изоляционного буфера ядер. Снова центрифугуйте на 10 минут при 800G и удалите супернатант. После полного смывания зелёных обломков храните изолированную суспензию ядер при 4 градусах Цельсия максимум в течение одной недели и иммунокрасьте ядра нужными антителами.

Нагрейте раствор агарозы с низким плавлением 1,5% по объёму при 90 градусах Цельсия в течение одной минуты, чтобы растворить порошок и получить прозрачный раствор. Короткое время Vortex, чтобы обеспечить полное сведение. Охлаждайте раствор и поддерживайте температуру при 37 градусах Цельсия, чтобы избежать термической денатурации буфера глюкозооксидазы.

После того как раствор агарозы с низким уровнем плавления достигнет 37 градусов Цельсия, подготовьте буфер STORM, добавив 100 миллимолярных буферов меркаптоэтиламина и глюкозооксидазы в агарозу с низким уровнем плавления, чтобы достичь в 1 раз выше конечной концентрации, и аккуратно перемешайте раствор. Нанесите 10 микролитров смеси ядер на озонированную крышку 1,5H, обработанную в течение 20 минут в системе ультрафиолетовой озоновой очистки. Подождите три минуты, чтобы ядра отложились на обложке.

Затем удалите лишнюю жидкость и подождите две минуты. Добавьте 10 микролитров подготовленной малоплавящей агарозы в крышку и сразу же накройте микроскопом. Герметизируйте скольжение крышки силиконовым герметиком.

Смешайте равные количества раствора А и В в небольшой чашке Петри с помощью наконечника микропипетки. Нанесите смесь по краям крышки, чтобы герметизировать образец. Дайте силиконовому герметику затвердеть на пять минут.

Закрепите образцовый стекло на микроскопе и найдите фокус. Найдите и сосредоточьтесь на ядре. Активируйте модуль для поддержания фокуса, если он доступен, чтобы обеспечить стабильность во время длительных захватов.

Выберите область, где один или несколько наноалмазов расположены рядом с ядром, чтобы улучшить коррекцию дрейфа во время реконструкции. Для двухцветной съёмки начинайте получение с более длинного канала волны, а затем переходите на канал с короткой длиной волны для завершения съёмки. Обработайте необработанные стеки изображений в ThunderSTORM с использованием гауссового подгонки с взвешенной оценкой наименьших квадратов и генерируйте реконструированные изображения.

Применяйте фильтрацию на основе сигмы и неопределённости ниже 30 нанометров для сохранения точной локализации и удаления шума. Наконец, выполните коррекцию дрейфа образца с помощью перекрёстной корреляции ThunderSTORM или алгоритма COMET и подтвердите минимальный сдвиг на восстановленных изображениях. Ядра были выделены из 15-дневных ростков дикого типа, иммуномаркированных вторичными антителами AF647, и контрокрашены Hoechst H33258.

Конфокальная визуализация показала несколько изолированных и хорошо сохранившихся ядер с минимальными обломками, хромоцентры и ядро были чётко различимы. Сигнал РНК-полимеразы II отсутствовал в хромоцентрах и нуклеоле. Дифракционные проекции максимальной интенсивности и соответствующие реконструкции SMLM выявили структурные детали маркировки РНК-полимеразы II и ДНК, включая увеличенные интересующие области с более мелкими структурами.

Локализационная фильтрация на основе сигмы и неопределённости улучшила определение как сигналов РНК-полимеразы II, так и ДНК по сравнению с обнаруженными локализациями. Дальнейшая доработка после коррекции дрейфа сохранила эту улучшенную структуру. Фильтрация на основе сигма-значений удаляла локализации с чрезмерно малыми или большими ширинами подогнанных параметров.

Анализ корреляции кольцев Фурье показал, что разрешение в канале AF647 улучшилось с 90,1 до 47,7 нанометра после фильтрации, тогда как канал JF549 улучшился с 56,6 до 27,9 нанометров. Сохранение ядерной целостности при минимизации обломков и фоновой флуоресценции критически важно для достижения высококачественной одномолекулярной визуализации. Будущие исследования могут связать ядерную архитектуру с регуляцией генов в условиях окружающей среды или развития.