Идентификация модифицированных гистонов в качестве связывающих субстратов члена семейства Спиндлин человека 4 (SPIN4) с помощью пептидных массивов и нативного вытягивания нуклеосом
27 марта 2026 г.
Генетические варианты у человека с членом семейства Спиндлин 4 (SPIN4) недавно были выявлены у пациентов с избыточным ростом костей — новым расстройством развития. Представлен протокол и новые результаты, описывающие биохимическую идентификацию модифицированных гистонов в контексте нуклеосом как субстратов, связывающих SPIN4.
SPIN4 — это считыватель, регулирующий развитие костей, контролирующий гистоны. Мутации SPIN4 вызывают чрезмерный рост, но их патогенная роль остаётся неясной. Этот протокол может быть адаптирован и применён для изучения связывающих субстратов белков, связывающих гистоны, во всех пространствах.
Для начала подготовьте блокирующий буфер, взвесив пять граммов бычьей сыворотки альбумина, или BSA, и растворив его в 100 миллилитрах буфера хранения белка BC-150. Далее используйте гидрофобное перо, чтобы обвести зону реакции на пептидном массиве и сохранить реагенты. Затем положите фильтрующую бумагу в чашку Петри диаметром 15 сантиметров и смочите их водой.
Разместите массивы на увлажнённой фильтрующей бумаге и аккуратно добавьте 300 микролитров блокирующего буфера в каждую область массива. Накройте и инкубуйте чашку Петри при комнатной температуре в течение одного-трёх часов. Подготовьте один микромоляр рекомбинантного белка FLAG, помеченного Spindlin-4, или FLAG SPIN4, и 1X контроля пептида FLAG, каждый из которых находится в блокирующем буфере.
Перенесите реагенты и антенну массива в холодную комнату, чтобы уменьшить фоновый режим и улучшить соотношение сигнал/шум. Удалите лишний блокирующий буфер из массивов. Добавьте к каждому блоку белок FLAG SPIN4, или контроль пептида FLAG.
Накройте чашку Петри для ночной инкубации в холодной комнате. Добавьте 50 миллилитров буфера для промывки пептидного массива в промывочный бокс. Сбросьте раствор белка из массивов и перенесите его в буфер для промывки реакционной стороной вверх.
Промой массивы пять раз. Выполните первые два промывания по одной минуте каждая, затем три последующих промывания по пять минут каждое. Затем прополоснём блокирующим буфером, чтобы удалить остатки моющих средств.
Поставьте массивы обратно в чашку Петри. Добавьте 300 микролитров антитела против FLAG в каждый блок и инкубировать в течение часа при комнатной температуре. Сбросьте раствор антител, перенесите массивы в буфер для промывки и повторите промывки, как показано ранее.
Добавьте 300 микролитров вторичного раствора IgG, противомышиного козьего противомышиного антитела, в каждый блок и инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре. Отбросьте раствор антител и промыйте массив пять раз, как было показано ранее. Поместите массивы внутрь прозрачного листового защитного слоя и добавьте один миллилитр улучшенной хемилюминесцентной подложки, или ECL, чтобы обеспечить равномерное покрытие.
Удалите задержанные пузырьки воздуха. Захват хемилюминесцентных изображений в ярком поле с помощью цифрового имиджера. После загрузки исходного файла данных в программное обеспечение MODified Histone Peptide Array Analysis во вкладке Spot Alignment убедитесь, что каждая сетка центрирована на своей пептидной точке.
В Spot Statistics проверьте корреляцию дублированных точек и убедитесь, что ошибка меньше 5%. Используйте вкладку реактивности для оценки связывания различных модификаций гистона. Затем используйте вкладку «Специфичность» для определения относительного предпочтения целевой пептида по связыванию между различными модификациями гистона. Чтобы подготовить 2X буфер для блокировки бусеров, добавьте один грамм BSA в 10 миллилитров буфера для лизиса BC-150 и вихрь для растворения.
Перенесите мутантные шарики FLAG SPIN4 дикого типа и мутантные шарики FLAG SPIN4 D82H с эквимолярными концентрациями в отдельные трубки по 1,5 миллилитра. К образцу дикого типа добавьте равный объём 100-миллимолярных контрольных шариков с отрицательным пептидом 1X FLAG. Скорректируйте все образцы до равномерного объёма, используя соответствующее количество буфера лизиса BC-150.
Добавьте равный объём 2X буфера для блокировки шариков в каждую трубку, чтобы получить итоговый объём до одного миллилитра. Инкубировать ночь на ротаторе трубки, установленной при 4 градусах Цельсия и 20 об/мин. Для начала связывания нуклеосом разморозите 1X мононуклеосомы, извлечённые из HEK293FT клеток на льду.
Для начальной оптимизации вычислите соотношение 1X нуклеосомы к белку SPIN4 в один к молю. Смешайте 1X нуклеосому с равным объёмом 2X буфера блокировки шариков. Затем смешайте смесь с заранее заблокированными шариками в трубке объёмом 15 миллилитров и инкубуйте четыре часа на ротаторе трубки при температуре 4 градусов Цельсия и 20 об/мин для комплексирования.
Центрифугуйте смесь при 3000G в течение трёх минут при четырёх градусах Цельсия. После отброса супернатанта снова подвесьте шарики в один миллилитр лизисного буфера BC-150 и перенесите в трубки объёмом 1,5 миллилитра. Чтобы промыть бусины три раза, центрифугуйте при 3000G на одну минуту.
После удаления супернатанта взвешивают гранулу в одном миллилитре лизисного буфера BC-150. Время от времени перемешивайте трубку для равномерного распределения бусинок между повторными промывками. Затем выполните ещё две промывки, включая 10-минутный инкубационный шаг на вращателе при 20 об/мин и при четырёх градусах Цельсия между этапами ресуспензии и центрифуга.
После окончательной промывки подвесите бусины в девяти колонках буфера лизиса BC-150. Смешайте 160 микролитров шариков из каждого образца с 40 микролитрами 5-кратного буфера Laemmli. Нагрейте при 95 градусах Цельсия пять минут для денатурации.
Опционально, чтобы получить более чистые результаты с уменьшенным фоном, выполните иллюзию пептида FLAG для комплекса нуклеосом белка. Центрифугуйте при 3000G в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем проводите серебряное окрашивание и вестерн-блоттинг для проверки и обнаружения модифицированного гистонного SPIN4 связывания.
SPIN4 значительно связывается с гистоном H3 лизином 4, или H3K4, монометилом, диметилом и триметилпептидами. Напротив, мутант SPIN4 D82H показал снижение связывания со всеми целями, что подтверждает необходимость тюдорского домена 1 для связывания субстрата. Аффинность связывания SPIN4 негативно влияет на другие посттрансляционные модификации, которые требуют подтверждения, такие как H3R2me2 и H3R2me2a.
При последовательных наблюдениях пептидного массива SPIN4 D82H показал общее снижение связывания нуклеосом по сравнению с диким типом SPIN4. Western blot анализ, сравнивающий pulldown образцы SPIN4 и SPIN4 D82H, также показал отсутствие количественно измеримого связывания SPIN4 D82H с монометил, диметилом или триметил-H3K4 пептидами, что подтверждает эти двойные подходы для быстрого выявления относительных субстратов посттрансляционной модификации гистонов. Быстрая и целенаправленная валидация связывающих субстратов белков, связывающих гистоны.
Условия, необходимые для экспрессии и очистки белков, связывающих гистоны каждого кандидата, могут различаться. Масс-спектрометрия гистонов после нативного удлинения мононуклеосом, которая даст полный спектр PTM гистонов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Overview
This article presents a protocol for identifying the binding substrates of human Spindlin Family Member 4 (SPIN4), a histone reader implicated in bone growth regulation. The study details the use of peptide arrays and nucleosome pulldown assays to characterize the binding specificity of wild-type and mutant SPIN4, providing insights into its role as an epigenetic reader and its involvement in overgrowth syndromes.
Key Study Components
Area of Science
- Epigenetics
- Protein biochemistry
- Bone biology
Background
- SPIN4 is a histone reader protein involved in bone development.
- Loss-of-function mutations in SPIN4 are linked to pre- and post-natal overgrowth syndromes with X-linked dominant inheritance.
- SPIN4 contains three Tudor domains, which are potential epigenetic reader domains for methylated histone residues.
- The precise binding substrates and functional mechanisms of SPIN4 were previously unclear.
Purpose of Study
- To identify and validate the histone binding substrates of SPIN4.
- To compare the binding affinities of wild-type and disease-associated mutant SPIN4.
- To establish a rapid protocol for substrate identification of histone-binding proteins.
Methods Used
- Expression and purification of recombinant FLAG-tagged SPIN4 (wild-type and D82H mutant) using an insect cell system.
- Histone modification peptide array to assess binding specificity and affinity.
- Biochemical pulldown assays using native mononucleosomes extracted from HEK293FT cells.
- Silver staining and Western blotting to validate histone binding.
- Data analysis using MODified Histone Peptide Array Analysis software.
Main Results
- Wild-type SPIN4 binds specifically to histone H3 lysine 4 (H3K4) mono-, di-, and trimethylated peptides.
- The D82H loss-of-function mutant exhibits significantly reduced binding to all H3K4 methylation states, indicating the importance of Tudor domain 1.
- SPIN4 binding is negatively affected by additional post-translational modifications such as H3R2me2s and H3R2me2a.
- Western blot and peptide array results consistently show diminished nucleosome binding by the mutant compared to wild-type SPIN4.
Conclusions
- SPIN4 is a bona fide reader of H3K4 methylation marks.
- The D82H mutation disrupts SPIN4's substrate binding, highlighting the functional significance of Tudor domain 1.
- This protocol enables rapid and targeted identification of histone-binding protein substrates and can be adapted for other candidates.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Rapid identification of histone-binding substrates for epigenetic reader proteins like SPIN4 is critical for de-risking early discovery and clarifying target mechanisms in chromatin biology. This protocol enables quantitative assessment of binding specificity and functional validation, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. The approach is directly relevant for portfolio triage and prioritization of epigenetic targets in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of epigenetic reader protein substrate specificity for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by distinguishing wild-type from loss-of-function variants.
- Provides quantitative binding data to inform predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated peptide arrays and nucleosome pulldown assays for downstream workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative readouts for assay development.
- Enables reliable evaluation of compound or variant effects on histone binding.
Translational & Preclinical Research
- Aligns substrate identification with disease-relevant epigenetic mechanisms for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying functional consequences of mutations.
- Provides a platform for biomarker alignment in chromatin-modifying target programs.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for epigenetic reader proteins.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative, and reproducible binding data for screening campaigns.
- Analytics: Delivers statistical outputs and comparative measurements for variant and condition assessment.
- Translational Research: Connects substrate specificity to disease-relevant chromatin states when supported by functional data.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol adaptable to other histone-binding protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in epigenetic target validation.
- Operational Value: Standardizes substrate identification and enables reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of chromatin-modifying targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, peptide array handling, and chromatin biochemistry.
- Needs access to digital imaging, peptide array analysis software, and Western blot infrastructure.
- Demands cross-team standardization for data analysis and interpretation.
- Adaptation may be necessary for different histone-binding proteins or model systems.
- Expression and purification conditions may vary for each candidate protein, impacting throughput.
