Оптимизированный метод выделения эпителия уретры самок мыши для одноклеточного и иммунофлуоресцентного анализа

Наша группа заинтересована в изучении эпителиального паттерна в генитурном тракте. Этот протокол представляет собой оптимизированный метод изоляции эпителиальной оболочки уретры самки мыши для дальнейшего молекулярного и клеточного анализа. Методы, описанные в этой статье, помогут в изучении женской оболочки уретры и её роли в иммунной защите.

Для начала поместите усыпленную самку мыши CD1 в возрасте от 6 до 12 недель в положении на спине на столе для вскрытия. Распыляйте 70% этанола на живот, чтобы смочить волосы. С помощью щипцев поднимите кожу на животе.

Затем маленькими ножницами сделайте вертикальный разрез к нижней части тела, заканчивающийся наружным уретральным отверстием. Определите мочевой пузырь и аккуратно поднимите его щипцем, убедившись, что он пустой и без мочи. С помощью ножниц обрезают жир и соединительные ткани вокруг мочевого пузыря, чтобы обнажить бабочкообразную структуру, где две лобковые кости соединяются в лобковой симфизе.

Обратите внимание на уретру, проходящую под лобковым симфизом. Затем поднимите лобковый симфиз щипцами и разрежьте его ножницами. Удалять фрагменты лобковой кости, чтобы обнажить тонкую уретру, лежащую на вентральной поверхности стенки влагалища.

С помощью тонких щипцов аккуратно поднимите мочевой пузырь вверх из полости тела. Проведите ножницы между уретрой и стенкой влагалища, чтобы разделить мочевые и репродуктивные пути. Сохраняйте лёгкое напряжение мочевого пузыря при разрезе вдоль задней части уретры, чтобы отделить его от стенки влагалища.

Продолжайте разрез к дистальному уретральному отверстию, чтобы получить полноразмерную мышиную уретру длиной 1,2–1,5 сантиметра. Далее отделите уретру от мочевого пузыря, сделав один разрез на шее мочевого пузыря. Соберите от четырёх до пяти уретр в стерильную чашку Петри с свежим HBSS без кальция и магния.

Под расщепляющим микроскопом обрезайте жир и соединительную ткань вокруг уретры с помощью тонких щипцов и ножниц. Затем ножницами разрежьте каждую уретру поперечно на два одинакового размера. Положите кусочки ткани поверх нейлонового сетчатого сита объемом 100 микрон.

Промыйте ткани одним миллилитром HBSS, затем переместите их в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитра с одним миллилитром 1%трипсина, приготовленной в HBSS, дополненной антибиотиками и антимикотическими средствами. Далее инкубировать образец на вращателе при 30 оборотах в минуту и при 4 градусах Цельсия в течение 15–30 минут. После пищеварения добавьте в пробирку 10 миллимолярных хлорида магния, приготовленного в HBSS, затем 10 микрограммов на миллилитр ДНКзы, приготовленной в PBS.

Инкубировать трубку 15–30 минут на вращательном аппарате, помещённом в гибридизационную печь при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы закалить трипсин, переместите ткани уретры в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитра с 10% сывороткой овечьей в HBSS при комнатной температуре. Через пять минут перенесите ткани уретры в новую трубку с ледяной HBSS, а затем в стерильную чашку Петри с ледяной HBSS.

Во время осмотра образца под микроскопом держите один конец уретрального участка щипцем. Используя ещё одну пару щипцов, проведите вдоль всей длины уретрального участка, чтобы вытеснить прозрачный эпителиальный слой. Обрабатывайте часть изолированных эпителиальных слоёв уретры непосредственно для иммунокрашивания целого монтажа, чтобы визуализировать эпителиальные клетки и эпителиально-ассоциированные макрофаги in situ.

Используйте небольшую пластиковую пипетку, чтобы переместить эпителиальные частицы в капле HBSS, изолированной из четырёх-пяти уретр мышей, в стерильную чашку Петри. Используйте ножницы, чтобы измельчить эпителий на мелкие фрагменты. Переместить измельчённые эпителиальные фрагменты в двухмиллилитровую микроцентрифугную трубку с 1,5 миллилитрами предварительно нагретого раствора аккутазы при 37 градусах Цельсия.

Инкубировать образец на ротаторе при 37 градусах в течение одного часа. После инкубации переместите всё содержимое в пятимиллилитровую центрифугную трубку, содержащую два миллилитра буфера для промывания, состоящего из кальция и магния 1X PBS и 1% BSA. Центрифугуйте подвеску при давлении 600 G в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия с помощью вращающегося ротора.

Далее аспирируйте супернатант мягким пылесосом. Затем используйте пипетку с фильтром объемом 1 миллилитр, чтобы подвесить гранулу в один миллилитр буфера для мойки. Разбивайте гранулы, продвигая пипетом, пока комки не уменьшатся.

Пропустите подвеску через иглы калибра 23,5 и 26,5, каждая из которых прикреплена к шприцу объемом один миллилитр с четырьмя ходами для каждой иглы. Далее добавьте один миллилитр буфера для мойки, чтобы смочить поверхность предварительного фильтра для предварительного разделения на 30 микрон, установленного поверх пятимиллилитровой трубки. Используя шприц, соединённый с иглой калибра 26,5, пропустите один миллилитр суспензии клетки через фильтр.

Затем промой тюбик с помощью одного миллилитра буфера для стирки и пропусти через фильтр. Пульируйте клетки центрифугированием при 600 G в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия с помощью подвижного ротора. Аспирировать супернатант.

Восстановите пеллет в 100 микролитрах буфера для промывки и добавьте 100 микролитров буфера с лизисом эритроцитов. Ровно через три минуты добавьте четыре миллилитра буфера для стирки и перемешайте. Собирайте клетки центрифугированием при 600 G в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия с помощью вращающегося ротора.

Перед повторным суспензированием гранулы удалите супернатант в 50–200 микролитрах буфера для промывки в зависимости от размера гранулы. Смешайте пятимикролитровую аликвот клеток с пятью микролитрами трипан-синего и загрузите смесь на гемоцитометр для оценки выхода и жизнеспособности клеток. Оценить жизнеспособность клеток и количественно определить отдельные популяции клеток с помощью потоковой цитометрии.

Культивировать отдельные эпителиальные клетки уретры в матриксе базальной мембраны и органоидной экспансионной среде для формирования трёхмерных эпителиальных органоидов уретры. Проведите окрашивание гематоксилином эозином и флуоресцентное иммунокрашивание вложенных органоидных срезов для визуализации структуры и клеточного состава. Изолированные эпителиальные оболочки уретры имели более высокую прозрачность, чем стромальная ткань после отделения.

Иммунокрашивание эпителиальных оболочек целым монтажом показало сильное маркирование антителами к CDH1 к E-cadherin CDH1. Маркировка листов антителами к F480 показала, что макрофаги формируют ветвлённые дендритные структуры между эпителиальными клетками уретры. Отдельные клетки, выделенные из уретрального эпителия, демонстрировали стабильно высокую жизнеспособность за счёт исключения трипан-синего на гемоцитометре и проточной цитометрии с использованием амино-реактивного Ghost Dye V 450.

Изолированные клетки содержали обогащённую популяцию эпителиальных клеток после гейтинга на живых клетках. Примерно 1,3% положительных иммунных клеток CD45 и 1,18% макрофагов наблюдались в суспензиях отдельных клеток. Отдельные эпителиальные клетки, изолированные из уретры, оставались жизнеспособными и образовывали органоиды в трёхмерном матриксе, при этом рост органоидов наблюдался до шестого дня в культуре.

Окрашивание гематоксилин-эозином выявило две различительные морфологии эпителиальных органоидов уретры, включая крупные полые органоиды и более мелкие твёрдые органоиды. Как полый, так и твердый уретральные эпителиальные органоиды были стратифицированы и экспрессировали KRT5 и P63 в базальном слое. Они экспрессировали KRT-13 в сверхбазальных и промежуточных клеточных слоях.

Органоиды, образующиеся из проксимальной уретры, показали большую долю полых органоидов, тогда как органоиды из дистальной уретры образовывали более твёрдые сферы. Этот протокол позволяет исследовать типы уретральных клеток и самовозобновляемую способность эпителиальных клеток из проксимальной и дистальной уретры. Одним из важнейших аспектов этого протокола является тщательное вскрытие полноразмерной уретры и оптимальное ферментное расщепление для получения жизнеспособных эпителиальных клеток уретры для дальнейшего анализа.

Эпителиальные клетки, образуемые этим протоколом, могут использоваться для различных применений, включая секвенирование одноклеточной РНК, секвенирование объёмной РНК, потоковую цитометрию, иммунокрашивание и культуру органоидов.