Комплексная модель крыс для оценки путей транспорта печени с помощью одновременного отбора образцов лимфатических и кровососудистых систем

Наша лаборатория изучает роль лимфатической системы в воспалительных и кардиометаболических заболеваниях и разрабатывает стратегии доставки лекарств для воздействия на лимфатические органы для лечения этих заболеваний. Этот протокол позволяет оценивать процессы в печени, включая метаболизм лекарств, поток питательных веществ, иммунную сигнализацию и реакцию печени в различных условиях. Для начала поместите под хирургическим микроскопом анестезиированного самца крысы рода Спраг-Доули весом примерно 250–300 граммов, успешно заканюлированного через сонную артерию и яремную вену, в дорсальную лежачую вену.

Сделайте горизонтальный разрез кожи шириной 4-5 сантиметров от средней линии к правому боку, примерно на 1,5-2 сантиметра ниже грудной клетки. Оттяните кожу и сделайте соответствующие разрезы на наружных и внутренних косых мышцах. Прижгите или перевязывайте любые крупные кровеносные сосуды, встречающиеся во время процедуры.

Используйте ватные палочки, увлажнённые физиологическим раствором, чтобы сдвинуть печень к диафрагме, желудок — влево, а тонкий кишечник — вниз. Держите органы втянутыми с помощью марли, пропитанной физиологическим раствором. Определите печеночной лимфатический проток, идущий параллельно и слегка хвостово от печеночной артерии, медиально от правой почки и прилегающий к нижней полой вене.

Используйте более крупный непрозрачный или белый мезентериальный лимфатический проток в качестве анатомического ориентира для идентификации полупрозрачного и узкого печеночного лимфатического протока, расположенного хвостово. Используйте прямые щипцы Грефе для удаления соединительной ткани, лежащей над лимфатическим протоком и полой веной. Введите щипцы через жировое слое под правой почкой, чтобы создать туннель под полой веной.

Продвигайте щипцы до тех пор, пока кончики не выходят параллельно печеночному лимфатическому протоку на противоположной стороне полой вены. Используйте щипцы, чтобы схватить внешний конец заранее подготовленной канюли и протянуть канюлю через туннель, пока её кончик не появится на противоположной стороне. Используйте щипцы Halsted Mosquito Hemostat, чтобы согнуть кончик иглы 25 калибра примерно под углом 90 градусов.

С помощью согнутой иглы аккуратно проколите печеночной лимфатический проток справа, ближе всего к оператору. Проверьте канюлю, заранее наполненную антикоагулянтом, и удалите пузырьки воздуха, если таковые есть. Вставьте скошенный конец примерно на 2 миллиметра в воздуховод.

Подтвердите лимфопоток на внешнем конце канюли примерно 100 микролитров в час. Отрегулируйте или вставьте канюлю обратно, если поток не наблюдается. Закрой канюлю на конце сбора, затем нанеси небольшую каплю ветеринарного клея, чтобы закрепить место вставки.

Когда клей высохнет, подтвердите поток лимфы через трубку. После этого снимите марлю и верните органы в исходное положение. Поставьте трубку с антикоагулянтом под выходом канюли и убедитесь, что лимфа поступает капля в трубку.

Затем закройте брюшную стенку, последовательно зашивая внутренние косые, внешние косые и кожные слои. Сразу после каннуляции печеночной лимфы начните регидратацию, вводя стерильный физиологический раствор с частотой 1,5–3,0 миллилитра в час через яремную вену. Следите за дыханием и рефлексами, поддерживая анестезию через носовой конус.

После терапевтического дозирования через яремную вену непрерывно собирайте печеночную лимфу в трубки с раствором антикоагулянтов. Меняйте сборные трубки ежечасно или по необходимости. Собирайте образцы крови сонной артерии в определённые временные моменты, поддерживая общий объём ниже 10% от предполагаемого объёма циркулирующей крови до терминального отбора.

Откройте разрез брюшной полости, чтобы открыть верхнюю брюшную полость при сохранении глубокой анестезии и стабильного дыхания. Используйте марлю, увлажненную физиологическим раствором, чтобы аккуратно убрать печень к диафрагме, желудок — влево и тонкую кишку снизу. Определите печеночную артерию, проходящую параллельно печеночному лимфатическому протоку, расположенную рядом с брыжейкой.

Получите поливиниловую канюлю с внешним диаметром 0,61 миллиметра и внутренним диаметром 0,28 миллиметра, предварительно заполненную раствором антикоагулянта, и удалите любые воздушные пузырьки. С помощью изогнутых щипцов радужки выделите короткий сегмент печеночной артерии. Наложите шов из шёлка 4-0 под артерию.

Аккуратно поднимите артерию и наложите второй шов дистально от первого. Завязывайте дистальный шов для контроля обратного потока, оставляя проксимальный шов развязанным для последующего закрытия. С помощью мелких микроножниц сделайте небольшой поперечный разрез примерно на 0,5 миллиметра в стенке артерии между швами.

Используйте кончик щипца Дюмона, чтобы поднять клапан сосуды и стабилизировать просвет сосуда для установки канюлы. Вставьте скошенный конец поливиниловой канюли в отверстие и продвигайте канюлю примерно на 2-3 миллиметра. Закрепите канюлю, завязывая проксимальный шов вокруг сосуды и канюлы.

Подтвердите правильное расположение, аккуратно вдыхая небольшое количество ярко-красной артериальной крови. Соберите 0,5–1 миллилитр крови в заранее маркированную трубку с антикоагулянтом. Лимфатическое восстановление внутривенно вводимых макромолекулярных препаратов в грудной, печёночной и мезентериальной лимфе демонстрирует полезность модели для оценки лимфатического транспорта.

Печеночная лимфа имеет значительно меньшее общее содержание липидов по сравнению с грудной и брыжейной лимфой, при этом концентрация белка сопоставима с концентрацией других источников лимфаты. Этот протокол позволяет одновременно измерять печёночную лимфу и кровь для оценки транспорта, обмена веществ и очищения молекул, включая лекарства, питательные вещества и сигналы. Точная каннуляция печеночного лимфатического протока технически сложна и требует тщательной анатомической идентификации и хирургической техники.

Будущие исследования могут использовать этот метод для картирования транспорта, клиренса и метаболизма печени, что способствует пониманию заболеваний печени и таргетных терапий.