Интегрированный метод моделирования фототромботического инсульта и in vivo optrode записи нейронной и астроцитной активности у мышей с поведением

В нашем исследовании разработан комплексный метод одновременной регистрации активности астроцитов и нейронов при ишемическом инсульте у мышей в условиях свободного поведения. Предыдущие методы позволяли регистрировать активность нейронов или астроцитов по отдельности. Наш протокол обеспечивает одновременный захват сигналов астроцитов и нейронов, начиная с самых первых моментов развития инсульта.

Для начала перенесите мышь линии C57BL/6J под глубокой анестезией в стереотаксическую установку, оснащенную маской для подачи анестетика. Контролируйте глубину анестезии каждые 10 минут, поддерживая температуру тела мыши в диапазоне от 36 до 37.5 °C с помощью нагревательного коврика с обратной связью. Закрепите мышь в стереотаксической установке с помощью ушных и ротовых фиксаторов, предварительно нанеся глазную мазь на глаза.

После симметричного закрепления головы аккуратно проверьте надежность ее иммобилизации. После депиляции и септической обработки кожи выполните разрез по срединной линии с помощью хирургических ножниц. Очистите надкостницу физиологическим раствором с помощью ватных тампонов, чтобы обнажить брегма и лямбда.

Опустите стеклянную микропипетку, чтобы последовательно коснуться брегмы и лямбды. Зафиксировав координату Z на цифровом штангенциркуле, отрегулируйте фиксирующую планку до тех пор, пока разница не станет меньше 0,04 мм. Опустите стеклянную микропипетку до касания с брегмой и обнулите цифровой штангенциркуль.

Последовательно сместите микропипетку на 2,3 миллиметра влево и вправо от брегмы. Зафиксировав координату Z, отрегулируйте ушные фиксаторы так, чтобы билатеральные различия составляли менее 0,04 миллиметра. После обнуления цифрового штангенциркуля в точке брегмы отметьте область моторной коры, соответствующую передней конечности, на расстоянии +1,5 миллиметра в передне-заднем направлении и +0,74 миллиметра в медиально-латеральном направлении.

Используйте микродрель и круглые сверла диаметром 0,5 мм, чтобы просверлить небольшое отверстие диаметром примерно 0,5 мм в отмеченном месте. Перед введением смешайте два аденоассоциированных вирусных вектора в равных объемах и коротко центрифугируйте образец. Опустите стеклянную микропипетку, подключенную к насосу для микроинфузии, в целевую зону на дорсовентральную глубину минус 0,94 мм от поверхности мозга.

Введите 400 нанолитров вирусной смеси, содержащей по 200 нанолитров каждого вектора, со скоростью 50 нанолитров в минуту. Медленно извлеките пипетку через 10 минут после завершения инфузии. Наложите швы на кожу головы, используя шовный материал 4-0 длиной 20 миллиметров с иглой 3/8 окружности, и поместите мышь на грелку до полного восстановления.

Спустя три-четыре недели после вирусной инъекции выполните процедуру, описанную ранее, до этапа разреза кожи головы. При выполнении разреза удалите участок кожи головы размером 1,5 сантиметра на 1,5 сантиметра, оставив достаточное количество кожи вокруг глаз. Очистите череп перекисью водорода и 0,9% раствором физиологического солевого раствора.

После определения брегмы сбросьте показания цифрового штангенциркуля на ноль. Используя сверло с круглым наконечником диаметром 0,8 мм, слегка зашерохните поверхность черепа. Отметьте область моторной коры, отвечающую за передние конечности.

На передне-заднем направлении — 1.5 millimeters и на медиально-латеральном — 0.74 millimeters. Используя эту метку в качестве центральной точки, начертите квадрат размером пять millimeter на пять millimeter. С помощью микродрели при скорости вращения примерно 10,000 revolutions per minute обведите контур квадрата.

Непрерывно подавайте ледяной физиологический раствор в зону сверления и немедленно прекратите процедуру, если костный лоскут станет подвижным. Просверлите три небольших отверстия диаметром 0,5 мм в области контрлатерального полушария и мозжечка. Установите в отверстия винты для краниопластики.

Убедитесь, что каждый винт достигает твердой мозговой оболочки, но не проникает глубже, чтобы избежать повреждения тканей мозга. С помощью пинцета извлеките освобожденный костный лоскут. Используйте ультратонкий пинцет с кончиком размером менее 0,03 мм на 0,01 мм, чтобы удалить твердую мозговую оболочку в области краниального окна, избегая прямого контакта с тканью мозга.

Закрепите оптрод на рычаге микromanипулятора стереотаксической рамы и переместите его над краниальным окном. Надежно соедините серебряные заземляющий и референсный провода оптрода с тремя винтами краниопластики. Очистите поверхность краниального окна стерильным физиологическим раствором.

Медленно опустите оптрод на нужную дорсо-вентральную глубину -0,94 мм со скоростью 1 мм за 10 секунд. После имплантации нанесите слой агарозы на краниальное окно. Нанесите от трех до четырех слоев стоматологического цемента.

После затвердевания зубного цемента обеспечьте анальгезию в течение трех-пяти дней и дайте мыши восстановиться в течение одной-двух недель. Для возбуждения GCaMP6s используйте систему двух- или трехволновой фберейной фотометрии. Настройте сигнальный канал на 470 нанометров, а контрольный канал — на 410 нанометров.

Установите частоту дискретизации на уровне 60 кадров в секунду. Теперь надлежащим образом заземлите все компоненты системы записи. Во время записи используйте общий медианный эталон.

Убедитесь, что в программном обеспечении для записи выбраны сигналы широкополосного и локального полевого потенциала, и в течение всего сеанса записи контролируйте уровень шума. После кратковременного наркотизирования мыши подключите оптод к линии записи с помощью адаптера. Поместите мышь в условия, имитирующие домашнюю клетку, для проведения записи.

После пробуждения дайте мыши 10 минут для акклиматизации. Запишите выполнение мышью теста силы хвата, который предполагает одно потягивание в минуту в течение пяти минут. Точно зафиксируйте временные метки поведенческих тестов как в многоканальной системе, так и в системе волоконной фотометрии.

Введите 1,5% раствор красителя бенгальского розового внутрибрюшинно в дозе 10–20 мг/кг и подождите пять минут. После достижения и поддержания глубокой анестезии подключите оптродный зонд к источнику лазерного излучения. Для индукции фокальной ишемии воздействуйте лазерным лучом с длиной волны 530 нм и мощностью 15 мВт через имплантированный оптрод в течение пяти–восьми минут.

Для проведения оптогенетической стимуляции подключите лазерный стимулятор к оптроду. Включите оптогенетический лазерный стимулятор с длиной волны 488 нанометров и установите мощность 10 милливатт на пять минут для Opto-vTrap. В завершение поместите мышь на нагревательную подложку для восстановления.

По сравнению с исходным уровнем, церебральный кровоток снизился после фототромбоза и оставался подавленным через один и семь дней после инсульта. Сила захвата передних конечностей продемонстрировала высокозначимое снижение через один день и оставалась подавленной через семь дней после инсульта. Транзиенты кальция в астроцитах, зарегистрированные с помощью фиброфотометрии, и нейронные спайки, полученные методом электрофизиологии, были синхронизированы по временным меткам.

После фототромботического инсульта частота разрядов была значительно подавлена как в пирамидальных нейронах, так и в интернейронах по сравнению с исходной активностью во время выполнения задачи по захвату передней конечности. В исходном состоянии пики астроцитарных кальциевых транзиентов наблюдались в течение четырех-шести секунд после начала задачи. Однако амплитуда была значительно снижена после фототромботического инсульта, что отражало ослабление кальциевой активности.

Растровые диаграммы и перистимульные временные гистограммы показали изменения нейронной активности во время оптической стимуляции. Частота разрядов как пирамидальных нейронов, так и интернейронов значительно снизилась после оптической стимуляции по сравнению с базовым уровнем до стимуляции, что подтверждает наличие измеримого последующего эффекта модуляции астроцитов на возбудимость локальной цепи. Данный протокол позволяет осуществлять непрерывную запись физических упражнений и нейронной активности на протяжении всего периода после инсульта, от острой фазы до хронической стадии.

Успех данного протокола зависит от точного или скоординированного выравнивания. Монокулярная имплантация оптодов и достаточный уровень экспрессии вируса в течение всех операций. В будущих исследованиях можно использовать несколько имплантатов для мониторинга более обширных областей мозга или воздействия на различные типы клеток с применением разнообразных поведенческих тестов.