Микрофлюидная система для моделирования дисфункции эндотелиума при комбинированном физиологическом пульсативном сдвиговом стрессе и осцилляторной гипергликемии

В данном исследовании изучается, как синхронизированная осцилляционная гипергликемия и пульсативный сдвиговой стресс вместе приводят к эндотелиальной дисфункции при диабетических сосудистых заболеваниях. Существующие модели используют начальный высокий уровень глюкозы или стабильный ламинарный поток. Мы исследуем, как пульсативное сдвиговое напряжение противодействует осцилляционному повреждению глюкозы.

Для начала используйте программное обеспечение с автоматизированным проектированием для проектирования структуры микрофлюидного чипа. Изготавливайте основную форму SU-8 через коммерческую компанию. В чистой чашке смешайте полимер полидиметилсилоксана и предполимер в соотношении 10:1 по весу и энергично перемешайте смесь вручную в течение пяти минут.

Затем поместите контейнер в вакуумную камеру под давлением 0,08 мегапаскаля минимум на 15 минут, чтобы удалить воздушные пузырьки, застрявшие во время смешивания. Вылейте полидиметилсилоксан на пластину, помещённую в стеклянную чашку Петри. Дегазировать полидиметилсилоксан, вылившийся на пластину в десикаторе ещё на 15 минут, чтобы удалить образовавшиеся пузырьки во время литья.

Поместите чашу Петри с формой и полимером в горячую духовку, выровненную на 80 градусов Цельсия, на два часа. С помощью скальпеля аккуратно снять затвердевшую полимерную плиту из основной формы. С помощью инструмента для пробивания сердечника создайте входные и выходные порты на определённых концах канала на полимерной плите.

Очистите стеклянную крышку и узорчатую поверхность полимерной плиты клейкой лентой. Далее обработайте как полимерную плиту, так и стеклянную крышку плазменным очистителем мощностью 65 ватт под комнатным воздухом в течение 60 секунд. Немедленно выровняйте лицо полимерного канала с обработанной стороной стеклянной крышки.

Затем аккуратно нажмите, чтобы создать постоянно закрытый микрофлюидный канал. Поместите связанный микрофлюидный чип в бутылку из боронизированного стекла, наполненную деионизированной водой. Стерилизуйте автоклавом при 121 градусе Цельсия и 15 фунтах на квадратный дюйм в течение 20 минут.

Поместите стерилизованный чип в 60-миллиметровую культурную чашу, наполненную эквимолярной смесью PBS и низкоглюкозного DMEM. Затем, используя шприц объёмом один миллилитр, введите в канал 100 микрограмм на миллилитр фибронектина и инкубируем при 37 градусах Цельсия в течение четырёх часов. Затем добавьте 24,5 миллимолярного деманитола к низкоглюкозному DMEM для повышения осмотического давления.

Добавьте пять миллимолярных D-глюкозы к высокой глюкозе DMEM, чтобы получить итоговую концентрацию 30 миллимолярных глюкоз. Приготовьте нормальную среднюю и высокоглюкозную культурную среду с добавлением 20% FBS и 1% пенициллина стрептомицина. Затем тёплый PBS, трипсин, среду с нормальной глюкозной культурой и среду с высоким содержанием глюкозы в водяной бане при 37 градусах Цельсия.

Извлеките эндотелиальные клетки человеческой пуповиной вены из культивирующей чашки с коэффициентом 90%. Отсоедините клетки с помощью раствора 0,25% трипсина-ЭДТА. После инкубации клеток при 37 градусах Цельсия в течение 30 секунд подсчитайте собранные клетки и повторно суспензуйте их отдельно в нормальной глюкозе и высокоглюкозной среде при концентрации 1 умножить на 10 до мощности 6 клеток на миллилитр.

Используя шприц объёмом один миллилитр, введите 100 микролитров суспензии клетки во входной порт микрофлюидного чипа с нормальной глюкозной средой для контрольной группы и высокоглюкозной средой для экспериментальной группы. Поместите микрофлюидные чипы в увлажнённый инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа на 48 часов. Рассчитайте расход, необходимый для достижения целевого пульсативного сдвигового напряжения, используя приведённое уравнение.

Подключите источник давления к контроллеру давления. Затем подключите контроллер давления к контроллеру клапана, подключённому к компьютеру, для автоматического управления формами волн давления. Заполните два резервуара по 100 миллилитров: один — обычной средой для культуры глюкозы, другой — средой с высоким содержанием глюкозы.

Подключите резервуары к соответствующим каналам контроллера давления. Затем соедините резервуары и двухпозиционный трёхсторонний магнитный клапан с помощью силиконовой трубки. Установите целевое физиологическое пульсативное сдвиговое напряжение, соответствующее скорости потока примерно 200 микролитров в минуту.

Запрограммировать программируемый воздушный насос на создание функции синусоиды для поддержания пульсативного сдвигового напряжения. Далее запрограммируйте контроллер клапана на переключение каналов каждые пять минут, чтобы генерировать квадратную волну осцилляции глюкозы во время динамической стимуляции. Соедините двухпозиционный трёхсторонний магнитный клапан и микрофлюидный чип с помощью силиконовой трубки.

Затем запускайте программируемую насосную систему для запуска трубок. Далее, используя соединители из нержавеющей стали диаметром 1,3 миллиметра и углом 90 градусов, соедините входные и выходные порта микрофлюидного чипа к трубке. Подключите выход микрофлюидного чипа к резервуару для отходов, затем снова запустите насос, чтобы обеспечить комбинированное колебание глюкозы и пульсационное сдвиговое напряжение в течение 30 минут.

После проверки поля потока подготовьте рабочий раствор кальцеина AM и пропидиода йодида согласно инструкциям производителя на экспериментальной конечной точке. После однократного промывания канала PBS введите рабочий раствор кальцеина AM и пропидиевого йодида в канал и инкубуйте при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 30 минут в темноте. Немедленно сделайте флуоресцентные изображения окрашенных клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа с объективом в 10 раз более объективной линзой.

Немедленно сделайте флуоресцентные изображения окрашенных клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа с объективом 10x. Используйте зелёный фильтр с флуоресцеиновым изотиоцианом для кальцеина AM и тетраметилродаминовый или родаминовый красный фильтр для пропидиевого йодида. После трёхкратной промывки канала PBS введите раствор флуоресцентного зонда с живым окислительным стрессом в канал и инкубируете, как было показано ранее.

Промите канал PBS три раза, чтобы удалить неограниченный зонд. Немедленно захватывайте флуоресцентные изображения с помощью дальнего красного фильтра, установленного через объектив 20x при сохранении одинаковых параметров экспозиции во всех группах. Откройте полученные изображения кальцеина AM зелёного и пропидида йодида красного в ImageJ.

Вручную регулируйте порог для каждого канала, чтобы отличать флуоресцентные сигналы от фона. Используйте счётчик клеток для количественной оценки флуоресцентных клеток, корректируя минимальный размер ячейки на основе наблюдений для определения количества живых и мёртвых клеток в нескольких полях зрения. Рассчитывайте процент живых ячеек с помощью программного обеспечения для электронных таблиц для каждого экспериментального состояния.

Затем рассчитать среднее и стандартное отклонение по нескольким полям зрения с помощью программного обеспечения для статистического анализа для сравнения групп. Перетащите выбранное изображение в ImageJ. Выберите «Анализировать» и «Задать масштаб» для калибровки размера пикселя с помощью метаданных микроскопа.

Затем удалите неспецифический одинаковый фоновый сигнал со всего изображения с помощью функции вычитания фона, выбрав Process и Subtract Background. Далее выберите «Изображение» и «Корректируйте», затем «Порог», чтобы вручную настроить пороговый ползунок и определить внутриклеточный реактивный кислородный сигнал. Настройте измерения, выбрав Analyze и включив значения Set Measurements с Area и Mean Gray.

Выберите Анализ и Анализ частиц, чтобы определить минимальный размер ячейки на основе наблюдаемых размеров ячейки и измерить среднюю интенсивность сегментированного сигнала внутри ROI монослойной клетки. Указывайте уровень реактивных видов кислорода для каждого экспериментального условия как среднее по измеряемым значениям, полученным как минимум из трёх случайно выбранных полей зрения на каждый чип. Вводите количественные результаты в программное обеспечение для анализа данных и построения графиков.

Определите статистическую значимость, сравнивая экспериментальные группы с контрольной группой с помощью двухстороннего анализа дисперсии, затем теста Tukey post-hoc с уровнем значимости 0,05. Используйте программное обеспечение для анализа и генерации графиков с полосами ошибок, отражающими стандартное отклонение. Репрезентативные флуоресцентные изображения показали высокую долю жизнеспособных клеток во всех группах с незначительной гибели клеток в нормальной глюкозе и нормальной глюкозы в пульсативных сдвиговых стрессовых группах, тогда как осцилляторная глюкоза и осцилляционная глюкоза с пульсативными сдвиговыми стрессовыми группами демонстрировали заметное увеличение мертвых клеток.

Количественный анализ показал, что осцилляторное воздействие глюкозы приводило к значительному снижению жизнеспособности клеток по сравнению с контрольной группой, а применение пульсативного сдвигового стресса при осцилляторных условиях глюкозы значительно повышало жизнеспособность по сравнению с осцилляторной глюкозой. При нормальных условиях глюкозы уровень внутриклеточных реактивных кислородных форм был низким и дополнительно снижался после применения сдвигового стресса. В то время как осцилляторные условия глюкозы приводили к заметному увеличению интенсивности красной флуоресценции, что указывает на повышение реактивных форм кислорода.

Осцилляционное глюкозо-индуцированное увеличение количества внутриклеточных реактивных форм кислорода было снижено после применения сдвигового стресса. Количественный анализ показал, что сдвиговый стресс значительно снижает уровень реактивных форм кислорода при нормальных условиях глюкозы. В отличие от этого, осцилляторные условия глюкозы приводили к значительному увеличению уровня реактивных кислородных форм по сравнению с нормальной глюкозой.

Кроме того, сдвиговый стресс значительно снижал уровень реактивных кислородных форм, даже при колебательных условиях глюкозы. Этот протокол позволяет количественно оценивать уровни ROS и доступность клеток для изучения эндотелиальной дисфункции при колебательной гипергликемии и пульсирующем сдвиговом стрессе. После этой процедуры может проводиться молекулярный анализ, такой как путь NRF2 или сигнализация iNOS, чтобы разобрать механизмы защиты эндотелиев.

Будущие исследования могут использовать эту систему для изучения механобиологических путей, включения геометрий нарушения потока или совместной культуры гладкомышечных клеток.