4 августа 2026 г.
Цель этого протокола — обеспечить количественное измерение флуоресцентного времени на протяжении жизни зондов Riboglow для воспроизводимых процессов визуализации РНК in vitro, в живых млекопитающих и в трёхмерных клеточных моделях. Мы описываем рабочие процессы подготовки образцов, доставки зонда, сбора данных и количественного анализа для извлечения беспристрастных измерений срока службы флуоресценции.
Наше исследование направлено на визуализацию РНК в живых клетках для исследования пространственно-временной динамики РНК. Платформа Riboglow использует количественную флуоресцентную микроскопию изображений с измерением времени жизни фотонов в многокомпонентных системах, применимую к биологическим системам в состоянии здоровья и болезни. Для начала получите образцы РНК или клетки с зондами Riboglow, загруженными на бусинах.
Включите систему конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, затем устройство управления микроскопом. Включите систему флуоресцентной микроскопии изображений с измерением времени жизни фотонов на основе временного коррелированного счетчика одиночных фотонов, включая устройство для комбинирования лазеров, фотоумножительный детектор и таймер событий. После открытия программного обеспечения для получения и анализа изображений NIS, в окне настройки и конфигурации выберите AX с PicoQuant.
Когда программное обеспечение загрузится, выберите AX FLIM и FCS. Для настройки микроскопа для получения данных о времени жизни флуоресценции убедитесь, что в разделе AX pad выбрано Galvano. Установите значение усреднения в одно, а время задержки в два.
В разделе мощности лазера уменьшите отдельные ползунки лазеров до 3–4%. Установите ползунок для всех лазеров в положение один. После выбора объектива 20X в настройках области сканирования выберите 512 на 512 и включите детекторы. Для определения пути к файлу данных перейдите в нижнюю часть раздела контроллера и выберите конфигурацию.
После нажатия вкладки PicoQuant или FLIM FCS, под путем рабочего пространства, выберите символ папки справа. В месте хранения создайте новую папку для экспериментов на день и закройте окно конфигурации. Как только выбран режим "live" и появляется окно получения изображения, снова выберите "live", чтобы приостановить сбор фотонов.
Для настройки окон получения данных флуоресцентной микроскопии изображений или FLIM щелкните правой кнопкой мыши по окну изображения в реальном времени и выберите плагин PicoQuant. Включите отображение кривой затухания, отображение временного следа и отображение статистики FLIM. Для настройки расположения лазеров для клеточного эксперимента перейдите в настройки эксперимента в верхней правой части страницы рядом с лазерами.
После нажатия "добавить" рядом с полем для многоканального красителя добавьте желаемые красители. Выберите режим эксперта. Настройте назначение детекторов для каждого спектра эмиссии.
Направьте перекрывающиеся спекты возбуждения и эмиссии на разные детекторы. На левой панели отрегулируйте порядок пропускания, чтобы минимизировать взаимное влияние красителей с перекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии. После сохранения и наименования новой конфигурации лазера выберите сохраненную конфигурацию для эксперимента.
Щелкните правой кнопкой мыши по окну получения данных в реальном времени. Выберите управление получением данных, а затем выберите XYZ обзор. Перед загрузкой культуры клеток для изображения для FLIM добавьте краситель ядер живых клеток и тщательно перемешайте его, вращая его легко на столе, и оставьте на 30 секунд.
Поместите емкость для изображения на столик микроскопа. Поместите емкость в нижний левый угол столика микроскопа. Прикрепите образец к столику при использовании объективов без воздуха, чтобы предотвратить смещение по оси XY.
Переключитесь на канал 4'6-диамидино-2-фенилиндола или DAPI. Используя ручку управления, доведите клетки до фокуса. При необходимости отрегулируйте чувствительность регулятора высоты Z, а если клетки не появляются на экране, отрегулируйте координаты XY.
Для включения системы идеального фокуса или автоматического фокуса PFS на правой стороне панели AX выберите лупу рядом с кнопкой PFS. Как только микроскоп автоматически нормализует высоту Z, убедитесь, что кнопка PFS загорается и отображается в фокусе. Используя детектор AX, найдите желаемые клетки с помощью канала DAPI.
Затем переключитесь на канал ATO 590, чтобы эффективно идентифицировать клетки, загруженные на бусинах. Как только клетка будет идентифицирована и центрирована двойным щелчком, переключитесь на AX FLIM и FCS. Убедившись, что выбрано 512 на 512, отрегулируйте размер кадра, щелкнув и перетащив его углы, чтобы он соответствовал клетке.
Позвольте измененному кадру покраснеть. Щелкните правой кнопкой мыши внутри кадра или выберите "live", пока кадр не покраснеет, чтобы подтвердить корректировку. После регулировки числа захватов до желаемого значения выберите "захватить".
Наблюдайте за новым окном захвата и окном прогресса захвата на правой стороне экрана. Как только программное обеспечение для анализа FLIM откроется, перейдите к правильному пути к файлам. Наблюдайте за тем, как захваты автоматически заполняют окно программного обеспечения для анализа.
Переимено
В данной статье представлен подробный протокол использования Riboglow-FLIM — системы генетически кодируемых РНК-биосенсоров, которая позволяет осуществлять количественную визуализацию молекул РНК в живых клетках млекопитающих с помощью микроскопии с определением времени жизни флуоресценции (FLIM). Описанный рабочий процесс охватывает подготовку образцов, получение изображений и количественный анализ, что облегчает изучение динамики и взаимодействий РНК как в контролируемых условиях, так и в живых клетках.
Количественная визуализация РНК в живых клетках млекопитающих является критически важной задачей для ранних этапов разработки лекарственных средств, особенно для понимания динамики некодирующих РНК и регуляторных механизмов. Методика Riboglow-FLIM обеспечивает надежное и воспроизводимое измерение локализации и взаимодействий РНК в сложных клеточных средах, что повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней и снижении рисков при изучении механизмов действия. Данная возможность укрепляет трансляционную преемственность от этапа поиска до доклинических исследований, предоставляя количественные данные о РНК с высоким пространственным разрешением.
Протокол Riboglow-FLIM интегрируется в континуум от первичных открытий до доклинических исследований, обеспечивая количественную визуализацию РНК: от валидации in vitro до анализа живых клеток и трехмерных моделей.