Анализ защиты амикацина для количественной оценки и визуализации инвазии клеток Escherichia coli

Мы сосредоточены на описании того, как адгезивные инвазивные E.coli проникают в эпителиальные клетки кишечника, и выявлении бактериальных факторов, способствующих этому процессу. Гентамицино-устойчивые изоляты ограничивают традиционные инвазионные анализы. Этот протокол на основе амикацина позволяет точно количественно оценивать внутриклеточные бактерии.

Для начала соберите все реагенты и материалы, необходимые для анализа вторжения. Далее получите замороженный запас глицерила инвазивного штамма Escharicia colli, или AIEC, из морозильника при температуре 80 градусов Цельсия. Используя стерильную деревянную палочку или наконечник пипетки, аккуратно соскресте бактерии с стебля и нанесите их на шнековую пластину Лурия-Бертани, или LB, чтобы получить отдельные колонии.

Инкубировать тарелку при 37 градусах Цельсия ночью. На следующий день, используя стерильную деревянную палочку или наконечник пипетки, выделите одну колонию из пластины шнека. Инокулируйте колонию в 3 миллилитра бульона LB и инкубуйте культуру при 37 градусах Цельсия при 200 оборотах в минуту за ночь.

Затем проведите 1–10 разбавлений ночной культуры в 1 миллилитре LB бульона. Измерьте оптическую плотность на 600 нанометрах разбавленной культуры с помощью спектрофотометра. Переливайте 100 микролитров ночной культуры в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитра и центрифугуйте при 6 000 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.

Аккуратно аспирируйте супернатант, не надвигая клеточную гранулу, и снова суспензуйте гранулу в 1 миллилитре сыворотки и антибиотико-антимикотических сред. Рассчитайте необходимый объём бактериальной суспензии для достижения множества инфекции или MOI 10, используя предоставленную формулу. Для подготовки инфекционной среды перенесите рассчитанный объём бактериальной суспензии в стерильную микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 миллилитра и составьте объём до 1 миллилитра с помощью сыворотки и среды, свободной от антибиотиков и антимикотов.

Аккуратно перемешивайте, несколько раз поднимая и опуская трубу. Подготовьте пластину на 96 лунок для определения единиц формирования колонии на миллилитр разбавленной за ночь бактериальной культуры, выполняя десятикратные последовательные разбавления в стерильном 1X PBS. Перелите 200 микролитров разбавленной за ночь культуру в первую лунку пластины.

Пипетить 20 микролитров посева в следующий ряд, содержащий 180 микролитров 1X PBS. Перемешивайте, поднимая и опуская 10 раз, и повторяйте процесс разбавления, пока не достигнете 10 до степени 6, используя свежий наконечник пипетки каждый раз. Теперь нанесите 10 микролитров точечного разбавления в три экземпляра — от 10 до степени 2–10 и до мощности 6 разбавлений на пластины LB шнека.

Дайте пятнам впитаться в шнек рядом с пламенем. Инкубировать пластины ночью при 27–30 градусах Цельсия, чтобы предотвратить чрезмерный рост колоний и получить чёткие отдельные колонии. Удалить здоровые слияющиеся монослои эпителиальных клеток Caco-2, культивируемые в 24-колодной культурной пластине, покрытой коллагеном, из инкубатора и аспирировать всю среду из каждой скважины.

Пипетить по одному миллилитру сыворотки и среды без антибиотиков и антимикотиков в каждую яму. Аспирируйте медиа, чтобы удалить следы среды, и повторите промывку ещё раз, всего два раза. Теперь добавьте 1 миллилитр предварительно подготовленной инфекционной среды с AIEC в каждую яме пластины с 24 лунками, содержащей клетки Caco-2.

Центрифугуйте пластину с 24 лунками при 500G в течение 15 минут при комнатной температуре для синхронизации контакта бактерий с эпителиальным монослоем и инкубуйте пластину при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение трёх часов, чтобы обеспечить бактериальную инвазию. Подготовьте среду с антибиотиками, добавив 240 микрограммов на миллилитр амикацина в предварительно нагретую сыворотку и среду, свободную от антибиотиков, антимикотики. После периода заражения аспирируйте среду из монослоев клеток Caco-2 и хорошо промыйте каждый с помощью 1 миллилитра сыворотки и среды, свободной от антибиотиков и антимикотов.

Аспирируйте среду и повторяйте стирку ещё раз, всего два раза. Затем пипетить по одному миллилитру 240 микрограмм на миллилитр среды с амикацином в каждую яму. Параллельно обработайте другой набор клеток гентамицином 100 микрограмм на миллилитр для сравнения и инкубуйте клетки при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 1 часа, чтобы уничтожить внеклеточные бактерии.

После инкубации аспирируйте медиа из каждой скважины. Добавьте 1 миллилитр PBS, чтобы смыть прилипшие бактерии. Аспирируйте PBS и повторите стирку ещё раз, всего два раза.

Теперь добавьте 200 микролитров 1%Triton X100, разбавленных в PBS, в каждую яму, и инкубировать на орбитальном шейкере со скоростью 90 оборотов в минуту в течение 10 минут, чтобы лизировать эпителиальные клетки. Пипеты поднимаются и опускаются примерно 30 раз на каждую скважину, чтобы отделить клетки от пластины. Далее выполните десятикратное последовательное разбавление клеточных лизатов в пластине с 96 лунками с помощью PBS.

Пластинка 10 микролитров точечного разбавления в тройной экземпляре — от неразбавлённого до 10 до мощности 3 разбавления на пластины LB-шнека. После того как пятна высохнут, инкубируют пластины на ночь при температуре 27–30 градусов Цельсия, чтобы получить прозрачные отдельные колонии. После инкубации удалите пластины и подсчитайте хорошо изолированные колонии из соответствующих пятновых разбавлений, содержащих более семи колоний на каждом участке по тройным экземплярам.

Наконец, рассчитайте инокулум и полученные единицы формирования колоний на миллилитр и процент инвазии с помощью уравнений. Лечение гентамицином или амикацином после заражения монослоев Caco-2 клеток инвазивным штаммом AIEC NRG857c или неинвазивным альфа-контрольным штаммом Escherichia coli DH5 приводило к аналогичным профилям инвазии. Эти результаты показали, что амикацин так же эффективен, как и гентамицин, в уничтожении внеклеточных бактерий и точно отражает внутриклеточную бактериальную нагрузку.

Лечение гентамицинорезистентных клинических изолятов Escherichia coli, полученных у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника, гентамицином, приводило к сильно варьирующим показателям восстановления бактерий от примерно 21 до 2, 788%. В отличие от этого, терапия амикацином значительно снизила восстановление бактерий во всех изолятах, что продемонстрировало его эффективность и позволило более надёжно измерять инвазии. Этот протокол позволяет точно количественно оценивать внутриклеточные бактерии и оценивать бактериальное вторжение в эпителиальные клетки. Дополнительные методы, такие как иммунофлуоресцентная микроскопия, могут быть использованы для дальнейшей проверки бактериального вторжения и проверки внутриклеточной локализации.

Будущие исследования позволят выявить новые факторы вирулентности и изучить пути хозяина, которые нацелены во время адгезивной инвазивной инфекции E.coli.