Трёхмерная иммунолокализация в мейоцитах кукурузы

Наше исследование сосредоточено на разработке 3D-подхода для изучения мужских мейоцитов кукурузы и визуализации мейотических белков в отдельных клетках. Помимо кукурузы, данный протокол может быть применен для изучения мейоцитов риса, ржи, ячменя и пшеницы. Для начала необходимо получить растения кукурузы на стадии V13, когда соцветия все еще растут внутри стебля.

В течение недели фиксации пыльников в стадии миоза, надев перчатки, осторожно надавите на утолщенную часть стебля в области бугорка, чтобы проверить, достаточно ли она размягчилась для разрезания. После приготовления необходимых буферов создайте увлажненную камеру, поместив от пяти до 10 увлажненных бумажных полотенец в пластиковый контейнер. Удалите из камеры излишки воды.

С помощью лезвия бритвы сделайте разрез стебля на уровне соцветия, чтобы обнажить ветви метелки и боковые ветви. После препарирования и сбора боковых ветвей оберните их полотенцами во влажной камере, поддерживая в камере комнатную температуру. Используя стереомикроскоп, соберите свежие пыльники из цветков в чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую 2 мл 1X буфера A или BA. Определите стадии митоза по размеру и цвету.

После переноса пыльников в новую чашку Петри диаметром 35 мм добавьте к пыльникам три миллилитра фиксирующего раствора. Герметизируйте чашку Петри парафильмом, чтобы предотвратить испарение формальдегида. Поместите чашку Петри диаметром 35 мм в большую чашку Петри, установленную на роторный шейкер, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 минут при скорости вращения 40–60 RPM.

Промойте пыльники тремя миллилитрами 1X BA. Перенесите пыльники в небольшую чашку Петри, закройте ее и поместите на ротационный шейкер при комнатной температуре на 45 минут, установив скорость от 40 до 60 RPM. С помощью чистого пинцета перенесите пыльники в небольшую 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую три миллилитра 1X BA.

После того как чашка Петри будет плотно запечатана парафильмом, поместите ее в чашку Петри большего размера. Накройте конструкцию алюминиевой фольгой и храните образец при температуре 4 °C до использования. В первый день приготовьте 2 mL раствора акриламида, смешав равные объемы акриламида и 2XBA.

Дегазируйте раствор акриламида под вакуумом в течение 5–10 минут перед добавлением сульфита натрия и персульфата аммония. Разлейте по 100 µL смеси акриламида и 2XBA в соотношении 1:1 в пробирки объемом 1,5 мл в соответствии с количеством подготовленных предметных стекол. Положите кусочки парафильма размером 2 см на 2 см на чашку Петри и расположите их под диссекционным стереомикроскопом.

После обрезки кончика наконечника пипетки ножницами, нанесите 50 µL раствора BA с пыльниками на парафильм. Нанесите 25 µL раствора BA на другой участок парафильма. Зафиксировав пыльники пинцетом, срежьте их кончики с помощью скальпеля.

После того как меиоциты будут выдавлены, с помощью пипетки перенесите их в каплю 25 µL буфера BA и осторожно перемешайте. Перенесите 10 µL смеси меиоцитов на отдельное покровное стекло. Быстро добавьте пять µL сульфита натрия и пять µL персульфата аммония в пробирку объемом 1,5 mL, содержащую акриламид и 2X BA.

Пипеткой нанесите 5 µL данной смеси на покровное стекло и перемешайте ее с мейоцитами. Сверху под углом 45 градусов наложите покровное стекло, покрытое полилизином. После полимеризации в течение 30–50 минут при комнатной температуре осторожно разделите покровные стекла с помощью лезвия бритвы.

Затем поместите их в чашку Петри стороной с прокладкой вверх. Промойте покровное стекло одним миллилитром 1XPBS с добавлением одного миллимоля этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и 1% Triton при комнатной температуре в течение двух часов. Подготовьте и смешайте первичные антитела, полученные от разных видов животных, чтобы обеспечить четкое разделение сигналов при детекции.

Добавьте 50 µL разведенного первичного антитела в центр покровного стекла с образцом. Затем поместите чашку Петри в увлажненную камеру на ночь. На второй день приготовьте 500 mL промывочного буфера, содержащего 1× PBS, 0.1% Tween 20 и 1 mM EDTA.

С помощью пипетки удалите раствор после ночной инкубации. Дважды промойте покровное стекло одним миллилитром промывочного буфера. После удаления буфера снова добавьте один миллилитр промывочного буфера и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре.

Повторите этот этап промывки еще семь раз. После окончательного промывания накройте чашку и оставьте ее на ночь во влажной камере. Приготовьте вторичные антитела, разведя их в блокирующем буфере в соотношении 1:50.

После удаления промывочного раствора добавьте по 50 µL разведенных вторичных антител в центр каждого планшета. Затем поместите чашку Петри в увлажненную камеру на два часа при комнатной температуре. После удаления раствора из лунки проведите промывку четыре раза, используя по 1 mL промывочного буфера, по одному часу для каждой промывки при комнатной температуре.

Промойте лунку 1 mL PBS в течение 10 минут и повторите этот процесс еще дважды. Добавьте в лунку 500 µL DAPI, приготовленного до конечной концентрации 1 µg/mL, и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Извлеките пролонгированное золото из температуры 4 °C и разморозьте его до достижения комнатной температуры.

Промойте предметные стекла 1 мл PBS в течение 30 минут и повторите процедуру дважды. После удаления последнего промывочного раствора нанесите две капли средства для предотвращения выцветания (prolonged antifade) в центр области нанесения образца. Снимите покровное стекло из лунки и закрепите его на маркированных предметных стеклах.

С помощью вакуумного аспиратора удалите излишки глицерина с краев покровного стекла и загерметизируйте его двумя слоями лака для ногтей. Рассматривайте препараты под микроскопом, используя соответствующие длины волн возбуждения и фильтры для получения изображений. Окрашивание DAPI выявило четко выраженное ядро и окрашивание хроматина, а также более слабое естественное цитоплазматическое окрашивание ДНК пластид и митохондрий.

Отсутствие белков AFD1 (absence of first division one), ASY1 (asynaptic one) и ZYP1 (Zipper1) на хромосомах и в цитоплазме в период прелептинемы. На более поздних стадиях сигнал концентрировался на хромосомах, при этом значительное количество ZYP1 оставалось в цитоплазме до завершения синапсиса. Мейотический когезин AFD1 формировал линейную структуру только после зигонемы.

Одновременно с формированием линейных филаментов синаптонемного комплекса сигнал ASY1 стал сравнительно слабым после того, как ZYP1 и AFD1 были встроены в линейные структуры. Данный протокол позволяет исследователям изучать колокализацию и динамику белков, нативную субклеточную локализацию, трехмерную архитектуру хромосом, прогрессию и стадирование мейоза.

Основная сложность данного протокола заключается в тщательном подборе совместимых комбинаций первичных и вторичных антител. На базе этой работы могут быть проведены исследования по сравнению мужского и женского мейоза для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе ателхазмии.