Количественное изображение живой клетки формы ядра и динамики хроматина во время развития и воздействия стресса окружающей среды в корне Arabidopsis thaliana
5 июня 2026 г.
Этот процесс использует конфокальную микроскопию в сочетании с флуоресцентно маркированной линией ядра и маркера хроматина у Arabidopsis thaliana для одновременной фиксации динамики ядра и хроматина в корнях Arabidopsis и изучения изменений этой динамики в ответ на факторы развития и окружающей среды.
Наши исследования изучают гены и механизмы, обеспечивающие долгосрочное восстановление корней после осмотического стресса для укрепления культур от засухи. Хотя протокол разработан для корней arabidopsis, он может быть адаптирован к системам с флуоресцентными белковыми маркерами. Подготовьте для визуализации ростовые пластины с саженцами Arabidopsis thaliana.
Пипетте, 60 микролитров чистой воды на стеклянный слайд. Положите в воду три корня саженцев A.thaliana возрастом шести дней. Наденьте крышку размером 22x22 миллиметра 1,5 на корни, не закрывая листья.
В настройках конфокального микроскопа установите время экспозиции лазера на 1000 миллисекунд. В настройках лазерного комбайнера установите лазер диаметром 488 нанометров на 50% для изображения зелёного флуоресцентного белка, или GFP. Установите 561-нанометровый лазер на 50% для визуализации красного флуоресцентного белка, или RFP.
Снимите образец с помощью объектива 20X без оптического зума. Установите размер шага Z-среза на 0,3 микрометра. Установите интервал обследования на одну минуту, а общую продолжительность изображения — на 10 минут.
Найдите корни и выберите до 20 Z-срезов. Захватывайте 16-битные изображения. Запустите таймлапс и сохраняйте таймлапс в формате TIFF с помощью безпотерьевой компрессии.
Переместите полученные данные на компьютер для анализа. Откройте программу ImageJ или Fiji. Нажмите и перетащите VSI-файл в основное окно приложения ImageJ или Fiji.
В подсказке «Опции импорта форматов биографии» нажмите «ОК» в правом нижнем углу. Затем в запросе Bio Format Series Options убедитесь, что выбран Series 1. Нажмите OK в левом нижнем углу.
После загрузки изображения разделите сигналы, выбрав Изображение. Выберите Цвет и Разделённые каналы. Просмотрите отдельные окна, созданные для ядер с маркировкой GFP и хроматина с маркировкой RFP.
Определите, какое из двух окон изображения соответствует хроматину. После нажатия на окно изображения хроматина примените операцию проекта Z, выбрав Image, Stacks, а затем нажмите Z Project в основном окне ImageJ. Измените тип проекции на максимальную интенсивность.
Убедитесь, что All Time Frames активны, и нажмите OK, чтобы сгенерировать проекцию. Откройте меню контраста, нажав Control Shift C, или выбрав «Изображение» и выберите «Настраивать», а затем нажмите «Яркость» или «Контраст» в основном окне ImageJ. Сдвините планку Minimum влево, пока хроматин не станет чётко виден.
Перейдите к плагинам. Нажмите вниз на стрелку в меню Плагины, чтобы прокрутить до опции Отслеживания. Выберите Tracking и нажмите TrackMate.
Убедитесь, что настройки калибровки точны, и нажмите «Далее». Выберите Thresholding Detector и нажмите Next. Переходите к последнему кадру таймлапса в окне изображения.
Нажмите «Авто» рядом с порогом интенсивности и выберите «Предпросмотр». Отрегулируйте порог интенсивности и нажмите «Предпросмотр». Повторяйте процесс корректировки и предварительного просмотра, пока весь хроматин не будет включен с минимальным шумом, и нажмите «Далее».
Позвольте завершить начальное определение порога и нажмите «Далее». Вручную отрегулируйте порог, пока не будет виден только хроматин, и нажмите «Далее». Настройте отображение флуоресцентного изображения и нажмите «Далее».
Выберите Простой трекер LAP и нажмите Далее. Установите максимальное расстояние для соединения на 5 микрон, максимальное расстояние для закрытия разрыва на 15 микрон, максимальное расстояние для закрытия разрыва на 1 и нажмите «Следующий». Позвольте завершить отслеживание.
Посмотрите треки, отображаемые в оригинальном окне изображения, и нажмите «Далее». Нажмите зелёную кнопку плюс в левом нижнем углу, чтобы создать фильтр. Выберите количество мест в режиме трека.
Отрегулируйте ползунок порога. Убедитесь, что режим фильтра установлен на Выше, затем нажмите Далее. Нажмите кнопку «Треки» внизу страницы «Параметры отображения».
Выберите «Экспортировать в CSV». Игнорируйте встроенную страницу построения и нажмите «Далее». Ознакомьтесь с результатами анализа TrackMate.
Нажмите Capture Overlay, затем выберите Execute. Сохраните видео, выбрав «Файл» и нажав «Сохранить как», а затем выберите GIF. Обработанные солью корневые клетки выглядели под стрессом, а центромерные очаги — крупнее, чем в контрольных условиях.
Скорость хроматина была значительно выше в контрольных условиях, чем в условиях обработки хлорида натрия с 100 миллимолярными частотами. Этот протокол позволяет отслеживать и количественно оценивать движение флуоресцентно маркированного белка во времени в корнях арабидопсиса. Самой важной задачей в этом протоколе является получение качественных изображений, поскольку отбеливание фотографий и дрейф образца могут затруднять отслеживание.
Будущие исследования должны исследовать механизмы, лежащие в основе сниженного движения хроматина, наблюдавшихся в нашем исследовании.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Ядро эукариотических клеток подвержено динамическим изменениям формы, которые трансформируются в условиях стресса, например, при раке у животных или абиотическом стрессе у растений. В данном исследовании был разработан протокол визуализации живых клеток корней Arabidopsis thaliana с использованием двойных флуоресцентных маркеров ядерной оболочки и хроматина для количественной оценки динамики ядра и хроматина в контрольных условиях и при солевом стрессе. Конфокальная микроскопия в сочетании с Fiji/ImageJ и TrackMate позволила провести количественный анализ, который выявил снижение подвижности хроматина при солевом стрессе. Данный метод представляет собой надежный подход к изучению влияния абиотических стрессоров на архитектуру ядра и динамику хроматина в растительных клетках.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология растительной клетки
- Динамика ядра
- Мобильность хроматина
- Ответ на абиотический стресс
Теоретическое обоснование
- Форма ядра в живых клетках динамична, а не статична, как принято считать традиционно.
- Изменение морфологии ядра связано с раком в клетках животных и с воздействием стрессовых факторов окружающей среды в растениях.
- Ядерная оболочка взаимодействует с хроматином, влияя на экспрессию генов.
- Представления о том, как абиотический стресс влияет на форму ядра, его движение и динамику хроматина в растениях, остаются ограниченными.
Цель исследования
- Разработать алгоритм для количественной оценки динамики ядер и хроматина в живых клетках растений.
- Применить данный метод для оценки изменений в условиях абиотического стресса, в частности солевого стресса.
- Валидировать подход путем измерения движения хроматина в контрольных условиях и в условиях стресса.
- Обеспечить возможность последующего анализа реакций ядер и хроматина на воздействие факторов окружающей среды в корнях Arabidopsis.
Используемые методы
- Визуализация живых клеток корней Arabidopsis thaliana с помощью конфокальной микроскопии.
- Использование линии с двойной флуоресцентной меткой (белок ядерной оболочки и хроматин).
- Сбор изображений в контрольных условиях и в условиях солевого стресса.
- Анализ динамики ядер и хроматина в программе Fiji/ImageJ с использованием плагина TrackMate.
- Трекинг частиц для количественной оценки скорости и перемещения хроматина.
Основные результаты
- Движение хроматина в корнях, подвергнутых воздействию солевого стресса, было значительно снижено по сравнению с контролем.
- Система двойного мечения позволила одновременно визуализировать ядерную оболочку и хроматин.
- Программа TrackMate обеспечила точное отслеживание частиц и количественную оценку динамики.
- Данный метод позволил успешно зафиксировать количественные изменения в поведении ядер и хроматина в режиме реального времени.
Выводы
- Разработанный алгоритм позволяет проводить количественную визуализацию формы ядра и динамики хроматина в живых клетках корней растений.
- Солевой стресс приводит к снижению мобильности хроматина, что указывает на изменение динамики ядра при абиотическом стрессе.
- Данный подход может быть применен для изучения реакций ядра на различные стрессовые факторы окружающей среды.
- Метод закладывает основу для установления связи между архитектурой ядра, регуляцией генов и адаптацией растений к стрессу.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественная визуализация формы ядра и динамики хроматина в живых клетках корней Arabidopsis представляет собой надежную платформу для детального изучения клеточных ответов на воздействие стрессовых факторов окружающей среды с высоким разрешением. Данный подход обеспечивает высокую степень достоверности при установлении связи между изменениями архитектуры ядра и регуляцией генов, что способствует раннему обнаружению и механистическому снижению рисков в процессах разработки растительных биотехнологий. Количественные результаты данного метода позволяют принимать взвешенные решения с учетом рисков при разработке признаков и исследовании адаптации к стрессу.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать поведение ядра и хроматина в определенных условиях стресса.
- Обеспечивает механистическое снижение рисков путем количественного определения динамических реакций ядра на абиотические стимулы.
- Способствует функциональной валидации мишеней, связанных с ядерной оболочкой и хроматином.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированные количественные методы визуализации динамики ядра и хроматина.
- Позволяет проводить воспроизводимые измерения изменений, вызванных стрессом, в живых клетках растений.
- Поддерживает масштабируемый скрининг генетических или химических модуляторов, влияющих на архитектуру ядра.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет динамику ядра и хроматина с фенотипами адаптации к стрессу в модельных системах.
- Обеспечивает непрерывный переход от этапа открытия к доклинической валидации признаков стрессоустойчивости.
- Поддерживает прогностическое снижение рисков для трансляционных исследований в области улучшения сельскохозяйственных культур.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный конвейер визуализации и анализа объединяет этапы от ранних открытий до скрининга и трансляционных исследований в области биотехнологии растений.
- Фундаментальная биология: Количественная оценка динамики ядер и хроматина для выяснения путей ответа на стресс.
- Скрининг: Обеспечение воспроизводимых количественных результатов для разработки методов анализа и оценки соединений.
- Аналитика: Трекинг частиц и статистический вывод для надежного сравнения условий.
- Трансляционные исследования: Связь изменений архитектуры ядра с адаптацией к стрессу для подтверждения признаков.
- Применение в организациях: Возможность повторного использования рабочего процесса визуализации и анализа, адаптируемого к различным моделям растений и стрессорам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации ядерных и хроматиновых мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует визуализацию живых клеток и количественный анализ для обеспечения воспроизводимости.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки признаков адаптации к стрессу.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию генетических или химических вмешательств с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с конфокальной микроскопией и визуализацией живых клеток.
- Необходим доступ к линиям с двойными флуоресцентными маркерами и программному обеспечению для анализа изображений (Fiji/ImageJ, TrackMate).
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов визуализации и анализа данных.
- Метод может быть адаптирован для других видов растений при условии разработки подходящих маркеров.
- Ограничено доступностью совместимых флуоресцентных маркеров для целевых систем.
