Количественное изображение живой клетки формы ядра и динамики хроматина во время развития и воздействия стресса окружающей среды в корне Arabidopsis thaliana
5 июня 2026 г.
Этот процесс использует конфокальную микроскопию в сочетании с флуоресцентно маркированной линией ядра и маркера хроматина у Arabidopsis thaliana для одновременной фиксации динамики ядра и хроматина в корнях Arabidopsis и изучения изменений этой динамики в ответ на факторы развития и окружающей среды.
Наши исследования изучают гены и механизмы, обеспечивающие долгосрочное восстановление корней после осмотического стресса для укрепления культур от засухи. Хотя протокол разработан для корней arabidopsis, он может быть адаптирован к системам с флуоресцентными белковыми маркерами. Подготовьте для визуализации ростовые пластины с саженцами Arabidopsis thaliana.
Пипетте, 60 микролитров чистой воды на стеклянный слайд. Положите в воду три корня саженцев A.thaliana возрастом шести дней. Наденьте крышку размером 22x22 миллиметра 1,5 на корни, не закрывая листья.
В настройках конфокального микроскопа установите время экспозиции лазера на 1000 миллисекунд. В настройках лазерного комбайнера установите лазер диаметром 488 нанометров на 50% для изображения зелёного флуоресцентного белка, или GFP. Установите 561-нанометровый лазер на 50% для визуализации красного флуоресцентного белка, или RFP.
Снимите образец с помощью объектива 20X без оптического зума. Установите размер шага Z-среза на 0,3 микрометра. Установите интервал обследования на одну минуту, а общую продолжительность изображения — на 10 минут.
Найдите корни и выберите до 20 Z-срезов. Захватывайте 16-битные изображения. Запустите таймлапс и сохраняйте таймлапс в формате TIFF с помощью безпотерьевой компрессии.
Переместите полученные данные на компьютер для анализа. Откройте программу ImageJ или Fiji. Нажмите и перетащите VSI-файл в основное окно приложения ImageJ или Fiji.
В подсказке «Опции импорта форматов биографии» нажмите «ОК» в правом нижнем углу. Затем в запросе Bio Format Series Options убедитесь, что выбран Series 1. Нажмите OK в левом нижнем углу.
После загрузки изображения разделите сигналы, выбрав Изображение. Выберите Цвет и Разделённые каналы. Просмотрите отдельные окна, созданные для ядер с маркировкой GFP и хроматина с маркировкой RFP.
Определите, какое из двух окон изображения соответствует хроматину. После нажатия на окно изображения хроматина примените операцию проекта Z, выбрав Image, Stacks, а затем нажмите Z Project в основном окне ImageJ. Измените тип проекции на максимальную интенсивность.
Убедитесь, что All Time Frames активны, и нажмите OK, чтобы сгенерировать проекцию. Откройте меню контраста, нажав Control Shift C, или выбрав «Изображение» и выберите «Настраивать», а затем нажмите «Яркость» или «Контраст» в основном окне ImageJ. Сдвините планку Minimum влево, пока хроматин не станет чётко виден.
Перейдите к плагинам. Нажмите вниз на стрелку в меню Плагины, чтобы прокрутить до опции Отслеживания. Выберите Tracking и нажмите TrackMate.
Убедитесь, что настройки калибровки точны, и нажмите «Далее». Выберите Thresholding Detector и нажмите Next. Переходите к последнему кадру таймлапса в окне изображения.
Нажмите «Авто» рядом с порогом интенсивности и выберите «Предпросмотр». Отрегулируйте порог интенсивности и нажмите «Предпросмотр». Повторяйте процесс корректировки и предварительного просмотра, пока весь хроматин не будет включен с минимальным шумом, и нажмите «Далее».
Позвольте завершить начальное определение порога и нажмите «Далее». Вручную отрегулируйте порог, пока не будет виден только хроматин, и нажмите «Далее». Настройте отображение флуоресцентного изображения и нажмите «Далее».
Выберите Простой трекер LAP и нажмите Далее. Установите максимальное расстояние для соединения на 5 микрон, максимальное расстояние для закрытия разрыва на 15 микрон, максимальное расстояние для закрытия разрыва на 1 и нажмите «Следующий». Позвольте завершить отслеживание.
Посмотрите треки, отображаемые в оригинальном окне изображения, и нажмите «Далее». Нажмите зелёную кнопку плюс в левом нижнем углу, чтобы создать фильтр. Выберите количество мест в режиме трека.
Отрегулируйте ползунок порога. Убедитесь, что режим фильтра установлен на Выше, затем нажмите Далее. Нажмите кнопку «Треки» внизу страницы «Параметры отображения».
Выберите «Экспортировать в CSV». Игнорируйте встроенную страницу построения и нажмите «Далее». Ознакомьтесь с результатами анализа TrackMate.
Нажмите Capture Overlay, затем выберите Execute. Сохраните видео, выбрав «Файл» и нажав «Сохранить как», а затем выберите GIF. Обработанные солью корневые клетки выглядели под стрессом, а центромерные очаги — крупнее, чем в контрольных условиях.
Скорость хроматина была значительно выше в контрольных условиях, чем в условиях обработки хлорида натрия с 100 миллимолярными частотами. Этот протокол позволяет отслеживать и количественно оценивать движение флуоресцентно маркированного белка во времени в корнях арабидопсиса. Самой важной задачей в этом протоколе является получение качественных изображений, поскольку отбеливание фотографий и дрейф образца могут затруднять отслеживание.
Будущие исследования должны исследовать механизмы, лежащие в основе сниженного движения хроматина, наблюдавшихся в нашем исследовании.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Overview
The nucleus in eukaryotic cells exhibits dynamic shape changes, which are altered under stress conditions such as cancer in animals or abiotic stress in plants. This study developed a live-cell imaging pipeline in Arabidopsis thaliana roots using dual fluorescent markers for the nuclear envelope and chromatin to quantify nuclear and chromatin dynamics under control and salt-stressed conditions. Confocal microscopy combined with Fiji/ImageJ and TrackMate enabled quantitative analysis, revealing reduced chromatin movement under salt stress. The method provides a robust approach to study how abiotic stressors affect nuclear architecture and chromatin dynamics in plant cells.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Nuclear dynamics
- Chromatin mobility
- Abiotic stress response
Background
- Nuclear shape is dynamic in live cells, not static as traditionally depicted.
- Altered nuclear morphology is associated with cancer in animal cells and environmental stress in plants.
- The nuclear envelope interacts with chromatin to influence gene expression.
- Limited knowledge exists on how abiotic stress affects nuclear shape, movement, and chromatin dynamics in plants.
Purpose of Study
- To develop a pipeline for quantifying nuclear and chromatin dynamics in live plant cells.
- To apply this method to assess changes under abiotic stress, specifically salt stress.
- To validate the approach by measuring chromatin movement in control and stressed conditions.
- To enable future analysis of nuclear and chromatin responses to environmental stressors in Arabidopsis roots.
Methods Used
- Live-cell imaging of Arabidopsis thaliana roots using confocal microscopy.
- Use of a dual fluorescently tagged marker line (nuclear envelope protein and chromatin).
- Image acquisition under control and salt-stressed conditions.
- Analysis of nuclear and chromatin dynamics using Fiji/ImageJ with the TrackMate plugin.
- Particle tracking to quantify chromatin speed and movement.
Main Results
- Chromatin movement was significantly reduced in salt-stressed roots compared to control.
- The dual-tagging system allowed simultaneous visualization of nuclear envelope and chromatin.
- TrackMate enabled accurate particle tracking and quantification of dynamics.
- The method successfully captured live, quantitative changes in nuclear and chromatin behavior.
Conclusions
- The developed pipeline allows for quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in plant roots.
- Salt stress leads to decreased chromatin mobility, indicating altered nuclear dynamics under abiotic stress.
- This approach can be applied to study nuclear responses to various environmental stressors.
- The method provides a foundation for linking nuclear architecture to gene regulation and stress adaptation in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in Arabidopsis roots provides a robust platform for dissecting cellular responses to environmental stress at high resolution. This approach enables predictive confidence in linking nuclear architecture changes to gene regulation, supporting early discovery and mechanistic de-risking in plant biotechnology pipelines. The method's quantitative outputs facilitate risk-adjusted decisions for trait development and stress adaptation research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of nuclear and chromatin behavior under defined stress conditions.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying dynamic nuclear responses to abiotic stimuli.
- Facilitates functional validation of nuclear envelope and chromatin-associated targets.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, quantitative imaging assays for nuclear and chromatin dynamics.
- Enables reproducible measurement of stress-induced changes in live plant cells.
- Supports scalable screening of genetic or chemical modulators affecting nuclear architecture.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nuclear and chromatin dynamics with stress adaptation phenotypes in model systems.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of stress resilience traits.
- Supports predictive de-risking for translational research in crop improvement.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis pipeline integrates from early discovery through screening and translational research in plant biotechnology.
- Discovery Biology: Quantifies nuclear and chromatin dynamics to clarify stress response pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides particle tracking and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Links nuclear architecture changes to stress adaptation, supporting trait validation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis workflow adaptable to diverse plant models and stressors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in nuclear and chromatin target validation.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and quantitative analysis for reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for stress adaptation trait development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic or chemical interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and live-cell imaging.
- Needs access to dual fluorescent marker lines and image analysis software (Fiji/ImageJ, TrackMate).
- Demands cross-team standardization for imaging protocols and data analysis.
- Adaptable to other plant species with suitable marker development.
- Limited by availability of compatible fluorescent markers for target systems.
