Функциональная характеристика отдельных пре- и постсинаптических партнёров в центральной нервной системе личинок дрозофилы с использованием CaMPARI
June 16th, 2026
Этот протокол оценивает функциональную синаптическую активность между определёнными нейронными партнёрами in vivo в центральной нервной системе личинок Drosophila melanogaster с помощью генетически закодированных инструментов. CsChrimson-опосредованная оптогенетическая стимуляция пресинаптических сенсорных нейронов cIVda индуцирует кальциезависимую фотоконверсию CaMPARI в постсинаптических интернейронах Basin-4.
Наше исследование направлено на оценку функциональной синаптической связи между определенными нейронными узлами у живых и диссецируемых личинок Drosophila. Традиционные методы требуют диссекции или физической стимуляции. Этот протокол использует оптогенетику в неповрежденных личинках, уменьшая артефакты.
Для начала растопите среду из кукурузной муки в микроволновой печи в течение 8-10 секунд без кипения и оставьте ее охлаждаться при комнатной температуре без застывания. Перед полным охлаждением добавьте all-trans-ретинол, или ATR, в концентрации 0,5 миллимоляр для дополнения среды для мух, требующих активацию csChrimson. Покройте банки полностью алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить воздействие света.
Скрещивайте девственных самок, несущих гены CaMPARI и csChrimson, с самцами, несущими драйверные гены GAL4 и LexA, в пластиковых банках с подготовленной средой. Подготовьте параллельные банки без ATR в качестве контроля. Инкубируйте банки при температуре 25 градусов Цельсия до тех пор, пока личинки не достигнут стадии третьего возраста.
Используйте кисть для рисования, чтобы собрать личинку третьего возраста. Промойте личинку в трехъячеечной микропластинке с 0,1 молярным PBS для удаления любой прилипшей пищи. Разместите небольшое количество пластилина на каждом углу чистого 18 x 18 миллиметрового предмета стекла.
Поместите личинку в каплю PBS на предметное стекло и дайте ей ориентироваться вентральной стороной вниз. Поместите чистую предметную стекло на предметное стекло с личиной. Закрепите предметное стекло, приложив пластилин к углам, приложив достаточное давление, чтобы зафиксировать личинку, не раздавливая ее и не разбивая стекло.
Поместите слайд с личиной на стол конфокального микроскопа, оснащенного объективом 40x/1.2. В интерфейсе программного обеспечения микроскопа нажмите на Live. Затем под панелью Z Stack нажмите Set First, затем Set Last, а затем Stop для получения базового Z Stack постсинаптических нейронов, экспрессирующих CaMPARI.
В меню Channels установите зеленый канал 488 нанометров с 0,8% мощностью лазера. Затем установите красный канал 561 нанометр на 0,8% мощностью лазера. Под меню Z Stack установите значение Interval на 1 микрометр.
В меню Acquisition выберите Presets для установки разрешения 256 x 256 пикселей. Значение усреднения линии 2, двустороннее сканирование и скорость сканирования 9, позволяя автоматическое обновление времени пикселя. Выполняйте всю съемку в темноте, поддерживая идентичные параметры приобретения на протяжении всего эксперимента.
Установите фотоконверсионный свет 405 нанометров на 0,5% мощность лазера. И установите оптогенетический стимулирующий свет 561 нанометр на 0,8% мощность лазера. Нажмите Live, затем выберите Best Fit под панелью гистограммы.
Позвольте обоим лазерам одновременно стимулировать личинку в течение 30 секунд, затем остановите стимуляцию. Во время получения ZStack после стимуляции с использованием тех же параметров, что и в базовом состоянии, наблюдайте красную флуоресценцию CaMPARI в нейронах личинок, питающихся ATR, с минимальной фотоконверсией и контролируемых образцах. В программном обеспечении Fiji ImageJ нажмите на File, затем выберите Open.
В окне импорта BioFormats с настройками по умолчанию нажмите OK, чтобы открыть полученное изображение ZStack. Под меню Image выберите Color, а затем Split Channels, чтобы просмотреть красные и зеленые каналы полученного изображения. Для вычитания фона нажмите на Process, затем выберите Subtract Background.
В всплывающем окне установите радиус катышки на 50 пикселей, затем нажмите OK и выберите Yes в окне Process Stack. Затем под меню Analyze выберите Tools, затем выберите ROI Manager, чтобы открыть окно ROI. Используйте инструмент свободного выбора, чтобы обвести области интереса вокруг отдельных клеток.
В окне ROI выберите Add, чтобы сохранить выбранный контур. Затем нажмите Measure, чтобы сгенерировать результаты по площади, среднему значению, стандартному отклонению и интегральной плотности. Повторяйте процесс для нескольких клеток одной личинки по отдельности в зеленом и красном каналах.
После экспорта результатов в электронную таблицу измеряйте соотношение красное к зеленому или R к G интегральных плотностей для каждой клетки и вычисляйте эти значения, чтобы рассчитать среднее соотношение R к G на личинку для изображений до и после стимуляции. Наконец, рассчитайте изменение флуоресценции или дельта R к G, вычитая соотношение R к G до стимуляции из соотношения R к G после стимуляции, чтобы оценить постсинаптическую кальциевую активность. Исследования функциональной связи между нейронами дендритного окончания класса IV или cIVda и интернейронами в личинках третьего возраста показали, что интернейроны basin-4 проявляли зеленую флуоресценцию из-за экспрессии цитозольного CaMPARI до фотоконверсии и оптогенетической стиму
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a method to functionally validate synaptic connectivity in the Drosophila larval nervous system by combining optogenetic activation with CaMPARI-based calcium imaging. The approach enables researchers to assess activity-dependent synaptic signaling between identified sensory neurons and interneurons in intact, undissected third-instar larvae.
Key Study Components
Area of Science
- Neurobiology
- Functional connectomics
- Optogenetics
- Calcium imaging
Background
- Connectome studies have mapped synaptic connectivity in various species, including Drosophila.
- Electron microscopy provides detailed anatomical data but lacks functional information.
- Recent Drosophila research has identified key neuronal networks underlying specific behaviors, such as nociception.
- Class IV dendritic arborization (cIVda) sensory neurons form major synaptic contacts with Basin-4 interneurons by the third instar larval stage.
Purpose of Study
- To functionally assess synaptic connectivity between cIVda nociceptors and Basin-4 interneurons in Drosophila larvae.
- To demonstrate the utility of CaMPARI as an activity-dependent reporter in live, undissected larvae.
- To establish a proof-of-principle protocol combining optogenetic stimulation and CaMPARI photoconversion.
Methods Used
- Immobilization of third-instar Drosophila larvae on microscope slides.
- Optogenetic activation of cIVda nociceptors using the red-shifted channelrhodopsin CsChrimson.
- Simultaneous CaMPARI photoconversion in Basin-4 interneurons to detect calcium influx.
- Fluorescence imaging to monitor CaMPARI color change as a readout of synaptic activity.
Main Results
- Calcium-dependent photoconversion of CaMPARI was observed in Basin-4 interneurons following optogenetic stimulation of cIVda neurons.
- The method provided functional evidence of synaptic connectivity despite internal larval movements and focal plane changes.
- The approach validated the anatomical connections identified by connectome studies with functional data.
Conclusions
- CaMPARI-based photoconversion is a reliable indicator of synaptic activation in intact Drosophila larvae.
- The protocol enables functional validation of connectomic data in vivo.
- This method can be broadly applied to study neuronal network function in genetically tractable organisms.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Functional validation of synaptic connectivity is critical for de-risking target selection and advancing mechanistic understanding in neurobiology-driven drug discovery. This CaMPARI-based approach enables direct assessment of activity-dependent signaling between defined neuronal partners in intact systems, bridging the gap between anatomical connectomics and actionable functional data. Such methods enhance predictive confidence at the target validation and early discovery inflection points, supporting portfolio decisions in CNS and neurodevelopmental pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of functional synaptic connectivity beyond anatomical mapping.
- Supports mechanistic de-risking by confirming physiologically relevant neuronal interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Facilitates development of validated, activity-dependent readouts for neuronal assays.
- Provides quantitative, ratiometric outputs suitable for reproducible screening workflows.
- Enables robust assay standardization by integrating optogenetic stimulation with functional imaging.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional synaptic data with disease-relevant neural circuits in preclinical models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking connectomic and functional endpoints.
- De-risks translational biomarker strategies by confirming in vivo neuronal activity patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through assay development and preclinical research, providing a reusable platform for functional connectomics in genetically tractable systems.
- Discovery Biology: Validates synaptic function and pathway engagement in intact neural circuits.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables ratiometric measurement of calcium-dependent activity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges anatomical and functional data to inform disease-relevant model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable workflow adaptable to diverse neuronal targets and circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes functional readouts and supports reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes targets with validated functional relevance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of CNS and neurodevelopmental programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, calcium imaging, and genetic model systems.
- Needs fluorescence microscopy infrastructure and precise light delivery systems.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data interpretation.
- Adaptation to other model systems depends on genetic tractability and optical accessibility.
- Internal movement and focal plane changes in live imaging must be managed for reliable outputs.