Функциональная характеристика отдельных пре- и постсинаптических партнёров в центральной нервной системе личинок дрозофилы с использованием CaMPARI

Наши исследования сосредоточены на оценке функциональной синаптической связности между определёнными партнерами по нейронным узлам у живых и вскрытых личинок Drosophila. Традиционные методы требуют вскрытия или физической стимуляции. Этот протокол использует оптогенетику в целых личинках, редуцируя артефакты.

Для начала растопите кукурузную муку в микроволновке 8-10 секунд без кипячения и дайте ей остыть при комнатной температуре без затвердевания. Перед полным охлаждением добавьте all-trans-retinal (ATR) с концентрацией 0,5 миллимолярных веществ, чтобы дополнить среду для мух, требующих активации csChrimson. Полностью накройте флаконы алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить воздействие света.

Скрещиваются девственные самки с генами CaMPARI и csChrimson с самцами, носителями драйверов GAL4 и LexA в пластиковых флаконах с подготовленной средой. Подготовьте параллельные флаконы без ATR в качестве контроля. Инкубировать флаконы при 25 градусах Цельсия, пока личинки не достигнут третьей стадии.

Используйте кисть, чтобы собрать личинку третьего возраста. Прополосните личинку в трёхколочной микро-точечной пластине с 0,1 моляром PBS, чтобы удалить прилипшую пищу. Положите небольшое количество моделирующей глины в каждый угол чистого накладки 18 x 18 миллиметров.

Поместите личинку в каплю PBS на обложку и дайте ей ориентироваться вентральной стороной вниз. Положите чистый микроскопический стекло на крышку, в которой находится личинка. Закрепите крышку, нанеся на углы моделировочную глину, используя ровно столько давления, чтобы обездвижить личинку, не раздавливая её и не разбивая стекло.

Разместите стекло с личинкой на сцене конфокального микроскопа с объективом 40x/1.2. В интерфейсе программного обеспечения микроскопа нажмите Live. Затем под панелью Z Stack нажмите Set First, затем Set Last, а затем Stop Stop, чтобы получить базовый Z-стек постсинаптических нейронов, экспрессирующих CaMPARI.

В меню Каналы установите зелёный канал диаметром 488 нанометров с мощностью лазера 0,8%. Далее установите красный канал диаметром 561 нанометр на 0,8% мощности лазера. В меню Z Stack установите значение интервала на 1 микрометр.

В меню Acquisition выберите Preset, чтобы установить разрешение 256 x 256 пикселей. Среднее значение линии 2, двустороннее сканирование и скорость сканирования 9, что позволяет автоматически обновлять время пикселей. Выполнять все изображения в тёмной среде, сохраняя одинаковые параметры получения на протяжении всего эксперимента.

Установите фотоконверсионный свет диаметром 405 нанометров на 0,5% мощности лазера. А 561 нанометр — оптогенетическая стимуляция до 0,8% лазерной мощности. Нажмите Live, затем выберите Best Fit в панели гистограммы.

Позвольте обоим лазерам одновременно стимулировать личинку в течение 30 секунд, затем прекратите стимуляцию. Во время послестимуляционного получения ZStack с использованием тех же параметров, что и исходная линия, наблюдайте красную флуоресценцию CaMPARI в нейронах личинок, питаемых ATR, с минимальной фотоконверсией и контрольной реакцией. В программном обеспечении Fiji ImageJ нажмите на «Файл», затем выберите «Открыть».

В окне опций импорта BioFormats с настройками по умолчанию нажмите OK, чтобы открыть полученное изображение ZStack. В меню «Изображение» выберите «Цвет», а затем «Разделяемые каналы», чтобы просмотреть красный и зелёный каналы полученного изображения. Для фонового вычитания нажмите на Процесс, затем выберите Вычитать фон.

В всплывающем окне установите радиус катящегося шара на 50 пикселей, затем нажмите OK и выберите Yes в окне Process Stack. Далее, в меню Анализ, выберите Инструменты, затем Менеджер ROI, чтобы открыть окно ROI. Используйте инструмент свободного выбора, чтобы обвести интересующие области вокруг отдельных клеток.

В окне ROI выберите «Добавить», чтобы сохранить выбранный контур. Затем нажмите «Измерить», чтобы сгенерировать результаты по площади, среднему, стандартному отклонению и интегрированной плотности. Повторяя процесс для нескольких клеток одной личинки по отдельно зелёному и красному каналам.

После экспорта результатов в таблицу измеряйте соотношение красного к зелёному или R на G интегрированных плотностей для каждой ячейки и усредняйте эти значения, чтобы вычислить среднее соотношение R на G на личинку для изображений до и после стимуляции. Наконец, вычислите изменение флуоресценции или дельты R на G, вычитая предстимуляционное соотношение R на G из постстимуляционного отношения R на G, чтобы количественно оценить постсинаптическую активность кальция. Исследования функциональной связности между дендритной арборизацией класса IV (cIVda) и интернейронами бассейна-4 у личинок третьего возраста показали, что интернейроны бассейна-4 демонстрировали зелёную флуоресценцию благодаря цитозольной экспрессии CaMPARI до фотоконверсии и оптогенной световой стимуляции.

Красная флуоресценция не была обнаружена при исходных условиях, что подтверждает отсутствие фотоконверсии до стимуляции. Одновременное фотоконверсионное воздействие света и оптогенетическая стимуляция привели к фотопреобразованию CaMPARI из зелёной в красную флуоресценцию. Отсутствие красной флуоресценции в контроле указывает на то, что фотоконверсия была именно вызвана нейронной активностью, опосредованной csChrimson.

Дельта-красная с зелёной флуоресценцией была значительно выше у экспериментальных животных, чем у контролей ATR без АТР. Этот протокол может быть использован для подтверждения синаптического партнёрства, позволяя отслеживать пресинаптическую стимуляцию с последующим немедленным постсинаптическим ответом у живых развивающихся животных. Самый сложный этап — правильная иммобилизация животного требует достаточного давления, чтобы предотвратить движение без вреда животному.

Будущие исследования могут позволить отслеживать, формировать, укреплять и даже устранять синаптические связи между определёнными нейронными популяциями во время развивающегося животного.