Строительство и Имплантация Microinfusion системы для устойчивой доставки агентов Neuroactive.

Здравствуйте, меня зовут Майлз Каннингем. Вместе с Райаном О'Коннором и Сидни Вонг мы продемонстрируем создание системы микроинфузии для непрерывного введения нейроактивных веществ. Эта работа была выполнена в лаборатории нейрореконструкции в больнице Маклин при Гарвардской медицинской школе.

Мы выражаем благодарность Sydney rbe Foundation и Narsad за их щедрую поддержку. Мы установили, что нейроактивные агенты могут быть надежно доставлены в отдельные участки мозга с помощью вытянутой микроканюли из боросиликатного стекла с диаметром кончика в пять-десять раз меньше, чем у обычных доставочных канюль. На этом слайде мы показываем широко используемую инфузионную канюлю из нержавеющей стали рядом с микроканюлей, изготовленной нами в данной лаборатории.

Такое уменьшение размера канюли для доставки приводит к значительному снижению травматизации исследуемого участка мозга. Многие традиционные методы фактически вызывают повреждение в области интереса или непосредственно в ней, что ставит под сомнение достоверность любого полученного результата. На панели A вы можете видеть степень нарушения структуры локальной области, вызванного канюлей диаметром 0,32 мм, по сравнению с канюлей диаметром 50 микрон на панели B. Эти фотографии при малом увеличении представляют собой влажные препараты неокрашенных срезов Vibram.

Затем эти же срезы окрашивали гематоксилином и эозином и подвергали визуализации при большем увеличении. Для дальнейшей демонстрации снижения повреждения тканей при использовании микроканюли представлены компоненты системы микроинфузии: мини-осматическая помпа ALZET с модулятором потока из нержавеющей стали, у которого удален фланец. Также используются два-три сантиметра полиэтиленового трубки, изготовленная на заказ борисиликатная микроканюля и направляющая проволока калибра 28G; на изображении представлена собранная система микроинфузии, готовая к имплантации.

Для изготовления микроканюль с заданными характеристиками здесь используется стандартный вертикальный вытяжной прибор (пипеточный пуллер). Также подходят горизонтальные пуллеры. Боросиликатная трубка позиционируется и фиксируется путем изменения температуры нагревательного элемента и натяжения трубки.

Вы можете надежно изготовить микроканюли с определенным диаметром и длинными сужающимися стержнями. Кварцевые трубки Bora нагревают и подвергают осторожному давлению, чтобы придать трубке изгиб нужной величины. Данный изгиб делается на расстоянии от кончика микроканюли, соответствующем глубине целевой области мозга с учетом необходимого зазора над черепом.

Конечная длина дистальной трубки этой микроканюли в месте изгиба составляет примерно 9–10 мм. Видимо, не удовлетворившись результатом, Райан повторно вводит микроканюлю, чтобы произвести точную настройку и довести угол изгиба до идеала.

Использование алмазного резца дает гораздо лучший результат. Сидни демонстрирует метод разрезания боросиликатной трубки примерно в пяти миллиметрах проксимальнее изгиба, при этом трубка плотно зафиксирована на твердой поверхности, а дистальная часть микроканюли свободно свисает с края. Она делает круговой надрез на трубке.

Затем, прикладывая легкое давление, она аккуратно переламывает трубку по надрезу. Тонкий прозрачный кончик канюли можно окрасить перманентными чернилами для облегчения визуализации. В ходе операции под увеличением кончик микроканюли обрезают микродиссекционными ножницами до достижения нужного диаметра.

Диаметр кончика можно проверить с помощью окуляра или микроскопа. Радиальные направляющие проволоки изготавливают из нержавеющей стали калибра 28, разрезав ее на отрезки длиной примерно три сантиметра. Затем с помощью пинцета на конце каждой проволоки формируют небольшой крючок диаметром около двух миллиметров.

Проволоку для центровки помещают в чашку Петри вместе с отрезками полиэтиленовых трубок длиной два-три сантиметра в микроканюлях. Систему микроинфузии можно собрать с помощью инструментов, имеющихся в большинстве лабораторий. Микропинцеты, обычные пинцеты, хирургические ножницы и гемостатические зажимы помещают на стерильную салфетку для стерилизации.

Инструменты, компоненты системы микроинфузии, а также несколько листов алюминиевой фольги стерилизуют в стандартном автоклаве. Модулятор потока осторожно извлекают из упаковки и помещают в стерильную чашку Петри. Его надежно фиксируют гемостатическими зажимами, после чего с помощью ножниц удаляют пластиковый фланец из трубки модулятора из нержавеющей стали.

Миниатюрный осмотический насос также извлекают из упаковки и помещают в стерильную чашку Петри. Трубка из нержавеющей стали вставляется в полиэтиленовую трубку примерно на два-три миллиметра, после чего они герметизируются с помощью эпоксидного клея, активируемого светом. Для проведения тонких работ мы используем клей Lummi bond из моей нейробиологической лаборатории: заполняем шприц объемом 1 CC клеем Lummi bond и используем иглу 27 gauge в качестве аппликатора; под воздействием яркого света Lumon отвердевает всего за несколько секунд.

Мини-осмотический насос заполняют, удерживая его в вертикальном положении и осторожно вводя раствор с помощью иглы для заполнения, прилагаемой производителем. Рекомендуется контролировать объем жидкости, вводимой в насос, и/или взвешивать насос до и после заполнения, чтобы убедиться в его полном заполнении и отсутствии дефектов. Обратите внимание, что повторное использование насосов не рекомендуется.

Затем модулятор в сборе с прикрепленным полиэтиленовым трубками вставляется в мини-осмотическую помпу. При вставке пенного модулятора жидкость из помпы будет вытесняться в полиэтиленовые трубки. Следует отметить начальную длину заполненного жидкостью участка полиэтиленовой трубки; после активации помпы, инкубации со стерильным физиологическим раствором при 39 °C в течение 12 часов, эта длина должна увеличиться.

Активированный мини-осмотический насос погружают в стерильный физиологический раствор, который обеспечивает среду без пузырьков воздуха для завершающих этапов сборки системы микроинфузии. Шприц, оснащенный пластиковой трубкой малого диаметра и заполненный тем же раствором, что и насос, используют для вытеснения воздуха из незаполненной части полиэтиленовой трубки. Следует убедиться, что воздух из микроканюли также был вытеснен.

Аналогичным образом, дистальный конец полиэтиленовой трубки может потребовать расширения с помощью микропинцета, после чего в него вставляется проксимальный конец микроканюли. Теперь вся система очищена от воздуха и мертвого пространства; ее можно извлечь из солевого раствора и просушить стерильной марлей. Затем для фиксации микроканюли к полиэтиленовой трубке наносится клей Luma Bond. Чтобы снизить скорость потока мини-осмотической помпы примерно вдвое, в небольшую чашку Петри наливают стерильный расплавленный парафин и на короткое время погружают в него проксимальную половину мини-осмотической помпы.

Излишки парафина удаляют промоканием, после чего систему для микроинфузии помещают обратно в стерильный физиологический раствор и хранят до начала операции. Непосредственно перед хирургической имплантацией направляющую проволоку закрепляют в месте изгиба микроканюли.

Продольная ось направляющей проволоки выравнивается по той части микроканюли, которая будет вводиться в ткань мозга, и фиксируется люмоном в этом положении. После этого систему микроинфузии можно установить на манипулятор стереотаксического прибора.

Направляющая проволока фиксируется зажимом манипулятора, а насос привязывается сверху петлей стерильной шовной нити. Это позволит поддерживать его вес и обеспечит идеальное расположение микроканюли перпендикулярно поверхности черепа; путем осторожного изгибания направляющей проволоки пинцетом систему микроинфузии можно имплантировать с помощью стандартной стереотаксической процедуры. Трубка Boel фиксируется на поверхности черепа с помощью адгезива.

Мы используем дентат-материал Jaron для формирования низкопрофильного пьедестала. Затем излишек направляющей проволоки, выступающий над местом подготовки, срезают вровень с поверхностью пьедестала. С помощью режущего колеса, установленного на высокоскоростную дрель, мини-осмотическую помпу помещают подкожно в области лопаток животного.

Предлагаемый метод обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методиками. Он может быть модифицирован с учетом вида и возраста экспериментального животного. Кварцевую трубку можно придать форму, соответствующую поверхности черепа животного.

Таким образом, обеспечение надежной низкопрофильной фиксации исключает необходимость в массивном краниальном основании, что позволяет легко закрыть хирургическую рану над обтекаемым пьедесталом для микроинфузии; это снижает риск инфекции и дискомфорт для животного, а для закрепления системы на черепе требуется меньшая площадь поверхности. Следовательно, дополнительные или последующие процедуры могут быть выполнены без помех со стороны громоздкого основания. Однако самое важное заключается в том, что данный метод снижает инвазивность и травматизацию локальной среды в месте инфузии, тем самым сводя к минимуму эффект наблюдателя.

Это те изменения, которые активное наблюдение вносит в наблюдаемое явление.