УФ-метод ChIRP для проверяемой идентификации белков, непосредственно взаимодействующих с LncRNA: от культивированных клеток до мышиных яичек

В нашем исследовании был разработан метод cPDiRT — метод УФ-кросслинкинга для прямого картирования взаимодействий РНК и белков как в культурах клеток, так и в нативных тканях, таких как семенники, что позволило раскрыть молекулярные механизмы TUG1 в сперматогенезе. Данный протокол позволяет осуществлять прямое картирование взаимодействий РНК-белок в широком спектре систем: от культуральных клеток до целых нативных тканей. Для начала трижды промойте клетки GC2 с помощью PBS, чтобы удалить остатки культуральной среды.

Затем добавьте в чашку три миллилитра PBS и равномерно распределите раствор перед проведением сшивки. Облучите клетки в ультрафиолетовом кросс-линкере с длиной волны 254 нм при дозе 4 000 мДж/см². Соберите клетки в PBS и центрифугируйте клеточную суспензию при 3000G в течение пяти минут при температуре четырех °C.

После удаления супернатанта взвесьте осадок и убедитесь, что масса осадка составляет не менее 500 миллиграммов на образец. Соберите семенники самцов мышей линии C57BL6 в возрасте четырех недель. Промойте декапсулированную ткань семенников дважды, используя от 5 до 10 миллилитров DMEM.

Затем инкубируйте 100 mg ткани в 10 mL среды DMEM, содержащей коллагеназу IV в концентрации 1 mg/mL, при 37 °C. Продолжайте дигестию от 5 до 15 минут до высвобождения семенных канальцев. После этого центрифугируйте суспензию при 1000 ×g в течение одной минуты при 4 °C и удалите супернатант.

Промойте осадок 5–10 мл DMEM. Снова центрифугируйте суспензию при 1000G в течение одной минуты при температуре 4 °C. Повторно суспендируйте осадок в 0,25% трипсине, содержащем 1 мг/мл дезоксирибонуклеазы I. Инкубируйте суспензию при 37 °C от 5 до 15 минут.

Затем добавьте равный объем среды DMEM с добавлением 10% FBS, чтобы остановить ферментативное переваривание. Профильтруйте суспензию через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм. Центрифугируйте клетки при 2000G в течение пяти минут при температуре четырех градусов Цельсия.

Удалите супернатант и промойте осадок 5–10 миллилитрами PBS. Повторно центрифугируйте суспензию при 2000G в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия. Ресуспендируйте полученную суспензию одиночных клеток в PBS и равномерно распределите ее по культуральной чашке диаметром 15 сантиметров.

Проведите сшивку клеток яичек, как было показано ранее для клеток GC2. Для контрольных клеток стадию облучения пропустите. Соберите сшитые клетки.

Центрифугируйте суспензию при 3000G в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия и удалите супернатант. Чтобы обеспечить минимальную массу осадка 500 миллиграммов, объедините клетки семенников, выделенные как минимум из 10–12 мышей. После взвешивания осадка повторно суспендируйте его в буфере для лизиса клеток из расчета 100 миллиграммов осадка на один миллилитр буфера.

После перемешивания в вортексе подвергните образец воздействию ультразвука с помощью сфокусированного ультразвукового гомогенизатора или ультразвуковой ванны до тех пор, пока лизат не станет визуально прозрачным. Затем отберите аликвоты лизата объемом примерно 10 µL в микроцентрифужные пробирки для анализа РНК и белков. Добавьте к лизату 30 µL предварительно промытых магнитных частиц.

Инкубируйте образцы при 37 °C в течение 30 минут с осторожным перемешиванием в гибридизационном печи. Поместите образцы на магнитный сепаратор примерно на одну минуту или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Перенесите очищенный лизат в новую пробирку.

Поместите новую пробирку на магнитный штатив. Затем перенесите лизат в другую пробирку, чтобы удалить остатки магнитных частиц. Добавьте в каждый образец два объема гибридизационного буфера, доведенного до температуры 37 °C.

Добавьте биотинилированные ДНК-зонды из расчета 1 µL стокового раствора зонда с концентрацией 100 µM на 1 мл лизата. Инкубируйте образцы при 37 °C в гибридизационной печи при условии постоянного вращения (end-over-end rotation) в течение 12–16 часов. Непосредственно перед использованием трижды промойте 100 µL магнитных частиц со стрептавидином буфером для лизиса клеток.

Удалите остатки буфера после финальной промывки. Кратковременно центрифугируйте пробирки с реакционной смесью для гибридизации. Затем добавьте гибридизованный образец к промытым гранулам и аккуратно перемешайте.

Перенесите суспензию гранул обратно в исходную пробирку и инкубируйте при 37 °C с перемешиванием в течение 30–40 минут. После инкубации коротко центрифугируйте образцы. Поместите пробирки на магнитный штатив на одну или две минуты или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

Затем удалите супернатант. Чтобы промыть гранулы, добавьте один миллилитр промывочного буфера и инкубируйте пробирки в гибридизационном печи при 37 °C в течение пяти минут. После пятикратной промывки перенесите 1-10% гранул в новую пробирку для анализа РНК.

Наконец, добавьте 40 µL 1X SDS-буфера для образцов к оставшимся гранулам. Прокипятите образцы при 95 °C в течение 30 минут, чтобы элюировать белки и разорвать поперечные связи. Соберите белки для последующего анализа методом масс-спектрометрии.

Масс-спектрометрический анализ ChIRP выявил более 190 белков, содержание которых было повышено по сравнению с отрицательным контролем в клетках GC2. При дозе УФ-излучения 4 000 millijoules per square centimeter метод cPDiRT-MS позволил идентифицировать более селективный набор белков. Более двух третей этих белков совпали с белками, выявленными с помощью традиционного метода ChIRP-MS.

Большинство белков, идентифицированных как минимум по двум уникальным пептидам, воспроизводимо обнаруживались в биологических повторах как в клетках GC2, так и в семенниках мыши. Анализ генной онтологии воспроизводимо идентифицированных белков выявил биологические процессы, в целом соответствующие известным функциям TUG1. Сравнение наборов данных клеток GC2 и семенников мыши позволило выявить 15 общих обогащенных белков.

Улучшенный метод секвенирования после иммунопреципитации с усиленным сшиванием выявил четкие и специфические пики связывания белков PABPC1 и CCT3 на транскрипте TUG1. Метод cPDiRT позволяет исследователям идентифицировать и количественно определять белки, которые напрямую взаимодействуют со специфическими сшитыми РНК как в культурах клеток, так и в нативных тканях. Основной проблемой является достижение эффективного УФ-сшивания при обеспечении высокой специфичности прямых взаимодействий между РНК и белками.

Наш протокол будет способствовать проведению будущих исследований по применению данного подхода к другим видам РНК и тканей для изучения прямого взаимодействия РНК и белков в процессах развития и репродукции.