Принципы сайт-специфического рекомбиназы (SSR) Технология

Здравствуйте, меня зовут Франк Буххольц. Я руководитель группы в Институте молекулярной клеточной биологии и генетики Макса Планка. Мы занимаемся поддержкой этой работы.

Наша работа состоит из двух аспектов. Один из них посвящен скринингу РНК I. Другой — разработке сайт-специфической рекомбиназы для передовой геномной инженерии.

По образованию я биолог и молекулярный биолог, я изучал биологию. Затем я получил степень PhD в Европейской лаборатории молекулярной биологии в Гейдельберге, после чего прошел стажировку в Сан-Франциско в UCSF под руководством Майка Бишопа, где работал над моделями лейкемии у животных. Институт Макса Планка здесь, в Дрездене, стремится объединить, скажем так, как минимум два разных аспекта — биологию развития и клеточную биологию — в рамках попытки, которую, как мне кажется, можно описать так: их основной, фундаментальный тезис заключается в стремлении понять, как клетки формируют ткани.

В целом, в этом и заключается цель нашего института здесь, в Стоуне. По сути, мы работаем в двух областях. Одна из них касается проведения РНК-интерференционного (RNAi) скрининга с целью выявления новых функций ранее не охарактеризованных генов в биологических процессах.

Другим направлением является геномная инженерия, целью которой является разработка технологий, позволяющих осуществлять сложное редактирование геномов с помощью сайт-специфических рекомбиназ. Хотя сайт-специфические рекомбиназы были открыты, я бы сказал, в восьмидесятых годах — например, Cre-рекомбиназа, с которой мы работаем, была открыта в начале восьмидесятых. По сути, это белок бактериального фага, то есть вируса, который заражает бактерии.

Таким образом, это очень далеко от того, что используется сейчас, но было быстро признано, что эти ферменты могут выполнять крайне интересные функции, которые могут быть использованы и в других организмах. Сайт-специфические рекомбиназы — это белки, которые связываются с ДНК; они специфически связываются с определенной последовательностью ДНК, и при связывании с этими целевыми последовательностями они способны разрезать ДНК, а затем перестроить сайты таким образом, что они фактически осуществляют процесс лигирования. Таким образом, с помощью этой сайт-специфической рекомбинации вы можете перестраивать последовательности ДНК, подобно тому, как с помощью ножниц и клея можно соединить последовательности ДНК так, как они не были соединены ранее.

Таким образом, эти сайт-специфические рекомбиназы, как я уже сказал, были первоначально обнаружены в бактериях или бактериофагах, после чего было проверено, работают ли они в других организмах. Примечательно, что они выполняли свою функцию и в других организмах.

Таким образом, если в организме присутствует сайт-специфическая рекомбиназная мишень, которую вы, например, внедрили в него с помощью генной инженерии, эти ферменты выполнят свою функцию. Очень широкое применение имеют сайт-специфические рекомбиназы, в частности те, которым не требуются кофакторы, такие как flip-рекомбиназа или Cre-рекомбиназа, которую мы использовали в качестве отправной точки для работы, о которой говорим сегодня. Они функционируют без кофакторов.

И если вы экспрессируете их, например, в организме животного или в клетках животного, то они смогут найти в этом организме распознаваемые ими последовательности, после чего фактически произведут разрез и сшивку прямо там, вырезав определенные последовательности. Таким образом, этот фермент был очень успешно применен, например, в так называемом условном мутагенезе у мышей. Допустим, у вас есть ген, который вы считаете интересным, и вы хотите выяснить, какова функция этого гена.

Очень известным экспериментом является создание так называемой нокаутной мыши. За разработку этой технологии, позволяющей осуществить делецию гена у мыши, в этом году была присуждена Нобелевская премия. Однако иногда обнаруживается, что при нокауте определенного гена у животного выясняется, что данный ген является жизненно важным, и мышь погибает на очень ранней стадии эмбриогенеза.

Теперь это говорит вам о том, что ваш ген очень важен, но на самом деле не раскрывает его функцию. Поэтому одним из наиболее распространенных способов выяснить это сегодня является так называемый условный нокаут. Для этого вы фланкируете интересующий вас ген сайтами-мишенями для этих сайт-специфических рекомбиназ.

Это означает, что у таких мышей данный ген будет экспрессироваться так же, как и у мышей дикого типа. Однако если скрестить этих мышей с мышью, которая экспрессирует CRE-рекомбиназу, например, под управлением тканеспецифического промотора, то можно будет удалить интересующий ген только в определенных клетках, которые можно заранее задать в зависимости от того, где экспрессируется рекомбиназа. На основании этих экспериментов мы также знаем, что такие рекомбинации могут быть очень эффективными для делеции последовательностей во всем организме.

Это стало необходимым условием для нашей идеи по созданию рекомбиназы, которая разрезает в заранее определенном нами сайте. До этого момента одним из основных ограничений при разработке сайт-специфических рекомбиназ было то, что мишень распознавания приходилось специально встраивать в геном клетки или организма, который вы планировали использовать. Поэтому мы задумались: сможем ли мы преодолеть этот барьер?

По сути, используется молекулярная эволюция. Насколько мне известно, в настоящее время сайт-специфические рекомбиназы не применяются в терапии. Как я уже сказал, это происходит главным образом из-за того, что в организме человека нет сайта-мишени, который распознавался бы любой из рекомбиназ, существующих в природе.

Таким образом, сначала их необходимо модифицировать, чтобы стало возможным их применение в терапевтических целях. Сейчас мы находимся лишь в самом начале пути изучения этой возможности. Время покажет, действительно ли мы сможем разработать эти ферменты для терапевтического применения и окажется ли это осуществимым.