В пробирке и в естественных Биолюминесценция Reporter Гена изображений из человеческих эмбриональных стволовых клеток

Образование тератомы in vivo является золотым стандартом для определения плюрипотентности клетки или способности формировать все три зародышевых слоя. Тератомы также являются большим препятствием для трансплантации стволовых клеток, и в настоящее время мало что известно об их формировании в кинетике роста. После того, как недифференцированные клетки имплантируются в среду хозяина, разработка биолюминесцентного репортера, трансдукции генов и сверхчувствительного устройства с зарядовой связью или ПЗС-фотографии позволила проводить неинвазивную повторяющуюся оценку миграции, пролиферации и дифференцировки клеток in vivo.

В этом видео мы продемонстрируем подробный протокол для эффективного отслеживания пролиферации трансплантированных человеческих эмбриональных стволовых клеток у живой мыши. Здравствуйте, я Кит Уилсон из лаборатории Джозефа Ву на факультете медицины и радиологии Стэнфордского университета. Сегодня мы покажем вам процедуры визуализации эмбриональных стволовых клеток человека, как in vitro, так и после трансплантации живой мыши.

Эти процедуры включают следующие этапы биолюминесцентной визуализации эмбриональных стволовых клеток человека in vitro, подготовку мышей и инъекцию стволовых клеток для визуализации in vivo и биолюминесцентной визуализации трансплантированных клеток in vivo. Итак, давайте начнем с рассмотрения некоторых ключевых компонентов этих процедур. Для того, чтобы выполнить биолюминесцентную визуализацию эмбриональных стволовых клеток человека, вам сначала необходимо получить клетки, которые стабильно экспрессируют репортерные гены EL люциферазы, такие как люцифераза светлячков, управляемые конститутивным промотором, таким как убиквитин или eef one alpha культура, ваши EL люциферазы положительные человеческие эмбриональные стволовые клетки человека в условиях без питания.

Обычно мы следуем стандартному протоколу Y-ячеек и используем шестилуночные планшеты, покрытые матригелем с использованием либо кондиционных сред, либо коммерческих безпитательных сред. Для обнаружения люциферазоположительных клеток вам понадобится репортерный зонд Люцифера, уже подготовленный к этому. Аликвота Люцифера в одном к 1,5 миллилитру препаратами в конечной концентрации 45 миллиграмм на миллилитр.

Храните аликвоты при температуре минус 20 градусов по Цельсию, когда они не используются, и избегайте воздействия света, накрыв их бумажным полотенцем, когда они не хранятся. Чтобы визуализировать люциферазоположительные клетки, мы будем использовать две разные системы визуализации. Для процедуры in vitro мы будем использовать стерильную систему визуализации, Xeno IVUS 50, а для процедуры in vivo мы отправимся в Стэнфордский центр визуализации in vivo, чтобы использовать Xeno IVUS 200.

Эта система включает в себя интегрированный аппарат isof lorrine и индукционную камеру для временной анестезии мелких животных. Ладно, я понял себя. Перейдем к биолюминесцентной визуализации in vitro.

Для биолюминесцентной визуализации in vitro важно поддерживать стерильные условия. Поэтому система визуализации должна быть стерильной, предпочтительно в помещении для культивирования клеток. Перед визуализацией удалите клеточную среду и добавьте PBS ровно настолько, чтобы покрыть клетки.

Например, добавьте один миллилитр PBS в каждую лунку шестилуночного планшета, содержащего культуры эмбриональных стволовых клеток человека. Соотношение дерина к PBS должно быть один к 100. Поэтому добавьте по 10 микролитров дерина в каждую лунку из шести лунок.

Не забудьте отфильтровать дерин перед добавлением в культуру. Подождав одну минуту, поместите пластину в камеру, затем сделайте снимок, используя время экспозиции 10 секунд, отрегулируйте время экспозиции. Если сигнал насыщенный или слишком слабый, сигнал биолюминесценции отражает количество клеток, поэтому могут быть проведены количественные анализы, которые коррелируют сигнал с разным количеством клеток.

Это изображения, полученные с помощью типичного количественного анализа. В левом верхнем углу показано яркое поле колоний эмбриональных стволовых клеток человека. Мы знаем, что эти клетки несут наш репортерный ген, поскольку они флуоресцируют зеленым цветом постфактум.

Сортировка по синему цвету – это изящное окрашивание. На нижней панели показаны культурные колодцы с увеличивающимся числом клеток. Количество клеток коррелирует с сигналом биолюминесценции, как показано на этом графике.

Эта корреляция дает нам полуколичественный анализ для отслеживания пролиферации клеток in vivo. Итак, это процедура in vitro. Теперь перейдем к биолюминесцентной визуализации in vivo.

Чтобы визуализировать образование тератомы in vivo, мы введем эмбриональные стволовые клетки человека, экспрессирующие ген репортера люциферазы светлячков, в спину мыши и сделаем биолюминесцентные снимки с помощью системы IVU. Когда вы будете готовы к пересадке клеток, используйте дисковое пространство или коллагеназу, чтобы ослабить клетки, промыть несколько раз и суспензировать их в смеси фактора роста, уменьшенного матригеля и дмм, соотношении один к одному. Как правило, мы сначала смешиваем элементы с охлажденным DMM, а затем добавляем в матригель.

На каждый подкожный участок мы вводим 200 000 клеток, взвешенных в объеме от 50 до 100 микролитров смеси matrigel DMM. Номер ячейки можно регулировать в зависимости от области применения. Не забудьте держать все на льду перед инъекцией.

Как только клетки готовы, мы обезболиваем мышь, поместив ее в индукционную коробку. С включенным потоком изофтора. Примерно через одну минуту мышь обезболивается и может быть помещена на операционный стол с непрерывным изофтором.

Поскольку естественно автофлуоресцирует и может затенять биолюминесцентное изображение, нам нужно будет удалить волосы с тыльной стороны мыши. Проще всего это сделать с помощью электробритвы, но также можно использовать гели для эпиляции, протирать спиртом для последующей стерилизации кожи. Далее наберите вам сотню микролитров клеточной суспензии в шприц от 23 до 27 калибра иглами лучше всего, так как они не будут засоряться клетками.

Теперь введите клетки под кожу в спину мыши, потому что кожа довольно рыхлая. Большим и указательным пальцами сожмите и растяните область, которую вы хотите ввести. Вводите прямо под кожу, стараясь не проколоть слишком глубоко.

Кроме того, старайтесь не допускать соскальзывания иглы из места инъекции при нажатии на поршень. Это предотвратит создание отверстия в коже, через которое клетки могут просочиться. Если вы попытаетесь сделать инъекцию снова после введения клеток, подождите несколько часов, чтобы мышь проснулась и побегала, прежде чем снова погрузить ее в спящий режим.

При биолюминесцентной визуализации это позволяет избежать токсичности изофлурана. Итак, теперь мы готовы приступить к биолюминесцентной визуализации введенных клеток in vivo. Для следующих визуализирующих исследований мы будем использовать мышь, которая уже начала демонстрировать образование тератомы, для биолюминесцентной визуализации всего животного.

Мы делаем внутрибрюшинную инъекцию Люцифера в дозе 375 миллиграммов на килограмм массы тела. Поэтому нам нужно взвесить животное, находящееся под наркозом, чтобы рассчитать дозировку, ввести люцифер в брюшину, как раз от средней линии, оттянуть иглу назад и убедиться, что там нет крови, которая будет признаком того, что у вас поврежден внутренний орган. Если мышь начинает просыпаться, просто поместите ее обратно в индукционную камеру и подождите минуту или две.

Подготовьтесь к визуализации, поместив матовую черную бумагу в коробку для визуализации, чтобы она могла поглощать любой свет, не излучаемый эмбриональными стволовыми клетками человека. У мышей максимальный сигнал биолюминесценции обычно возникает через 15-40 минут после инъекции. Поэтому через 10-15 минут поместите мышь тыльной стороной вверх в камеру визуализации с изофтором.

Начните с времени воздействия 10. Если сигнал насыщенный, попробуйте уменьшить время воздействия. Если слишком слабая, то увеличьте выдержку.

После того, как время экспозиции сигнала будет оптимизировано для вашей мыши, начните делать снимки каждую минуту, пока сигнал не достигнет максимума. Лучше всего это сделать с помощью программного обеспечения для визуализации, чтобы выбрать интересующие области, которые закрывают места инъекций. Отслеживая интенсивность сигнала в каждой интересующей области, можно легко определить, когда сигнал начинает снижаться, указывая на то, что достигнута максимальная интенсивность сигнала.

Мы берем среднее значение трех последовательных изображений, которые встречаются вокруг максимума, и используем его в качестве конечного значения. Когда вы будете удовлетворены своими изображениями, извлеките мышь из изофтора и дайте ей проснуться в своей клетке. Обычно мышь должна проснуться в течение 15 минут.

По прошествии нужного промежутка времени биолюминесцентные снимки получаются. Животное может быть принесено в жертву в срезах тканей, используемых для гистологии. Итак, теперь, когда мы закончили с процедурами визуализации in vivo, мы можем более подробно ознакомиться с нашими результатами, а также взглянуть на некоторые предыдущие исследования из нашей лаборатории.

Вот биолюминесцентное изображение трех мышей с подкожными тератомами. Данные сигнала биолюминесценции были наложены на черно-белую фотографию мышей, сделанную автоматически для нас с помощью программного обеспечения для визуализации. Это пример того типа продольной визуализации, который возможен с люциферазой светлячков.

В этом случае мы вводили человеческие эмбриональные стволовые клетки непосредственно в сердце после первоначальной инъекции. Большинство клеток погибает в течение следующей недели, о чем свидетельствует снижение биолюминесценции над сердцем. Обратите внимание на черную стрелку.

Человеческие эмбриональные стволовые клетки, которые выживают после трансплантации, в конечном итоге образуют тератому в сердце, которую можно визуализировать как быстро растущий сигнал, начиная примерно с 14-го дня. Вы заметите, что на седьмой день есть вторая область биолюминесценции, обозначенная красной стрелкой, которая показывает дополнительную сердечную утечку человеческих эмбриональных стволовых клеток в брюшную полость. Это очень распространенное явление.

Мы только что показали вам, как получить биолюминесцентные изображения эмбриональных стволовых клеток человека, которые стабильно экспрессируют репортерный ген люциферазы, как in vitro, так и после трансплантации живой мыши. Этот метод позволяет проводить повторяющуюся визуализацию и мониторинг пролиферации клеток без необходимости жертвовать большим количеством животных для гистологии, которая может быть по своей сути неточной для количественного определения клеток. При выполнении этой процедуры на мышах важно помнить о правильной концентрации делуччи и избегать насыщения биолюминесцентного изображения слишком большими интервалами экспозиции.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.