Электрофоретического разделения белков

Разделение отдельных белков из сложных белковых смесей может быть осуществлено с помощью гель-электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE). Белки мигрируют под воздействием электрического поля через поры в матрице геля. Скорость миграции белка определяется сочетанием размера пор геля, заряда, размера и формы белка. В данном видео мы продемонстрируем метод электрофоретического разделения белков.

Здравствуйте, я доктор Бобул Чакраварти из Центра протеомики Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences. Сегодня я продемонстрирую вам процедуру проведения одномерного гель-электрофореза. Итак, приступим.

Для начала соберите сэндвич из стеклянных пластин электрофоретической камеры согласно инструкциям производителя, используя две чистые стеклянные пластины и два проставочных кольца толщиной 1.5 millimeter. Теперь зафиксируйте сэндвич из стеклянных пластин на штативе для отливки геля. Затем приготовьте раствор разделяющего геля, способ приготовления которого описан в текущих протоколах.

Добавьте в раствор указанное количество 10% сульфата аммония и ТЕАП, затем осторожно перемешайте до однородности. Благодаря высокой концентрации акриламида дегазация не требуется. С помощью одноразовой пластиковой пипетки объемом 10 мл немедленно нанесите раствор разделяющего геля в сэндвич вдоль края одного из спейсеров, пока высота слоя раствора между стеклянными пластинами не достигнет примерно 11 см.

Затем с помощью другого пипеточного дозатора медленно покройте поверхность геля слоем воды, насыщенной изобутиловым спиртом, или дистиллированной воды, толщиной примерно один сантиметр. Для этого осторожно наносите жидкость вдоль края одного, а затем другого разделителя. Оставьте гель для полимеризации на 30–60 минут. При комнатной температуре слой воды сверху обеспечивает полимеризацию акриламидного геля по прямой линии.

После полимеризации геля можно приступать к заливке концентрирующего геля. Сначала слейте слой дистиллированной воды, затем промойте 1x Tris-Cl в SDS при pH 8,8. Теперь приготовьте раствор концентрирующего геля согласно текущим протоколам.

Затем с помощью пластиковой пипетки медленно введите раствор концентрирующего геля в центр «сэндвича» вдоль края одного из спейсеров, пока уровень раствора в «сэндвиче» не достигнет отметки примерно в один сантиметр от верхнего края пластин. Будьте осторожны, чтобы не допустить попадания пузырьков воздуха в концентрирующий гель. После заливки геля вставьте тефлоновый гребень толщиной 0,75 миллиметра в слой раствора концентрирующего геля.

Дайте раствору разделяющего геля полимеризоваться в течение 30–45 минут при комнатной температуре; теперь можно приступить к подготовке образцов белка. Для начала подготовки образцов белка разбавьте часть анализируемого белкового образца в соотношении один к одному с 2X SDS-буфером для образцов.

Для разбавленных белковых растворов рекомендуется использовать смесь белка и 6x SDS-буфера для образцов в соотношении пять к одному. Если образец представляет собой осажденный белковый пеллет, растворите белок в 50–100 µL 1x SDS-буфера для образцов. Затем нагревайте образцы в течение трех-пяти минут при 100 °C на водяной бане в герметичной микроцентрифужной пробирке с завинчивающейся крышкой.

Затем осторожно извлеките тефлоновый гребень, чтобы не повредить края лунок из полиакриламида. После извлечения гребня промойте лунки 1X буфером для SDS-электрофореза. Затем с помощью пипетки заполните лунки 1X буфером для SDS-электрофореза.

После того как лунки будут промыты и заполнены буфером, закрепите кассету с гелем в верхней буферной камере. Следуя инструкциям производителя, заполните нижнюю буферную камеру рекомендуемым количеством 1X SDS-электрофоресного буфера. Затем поместите кассету, закрепленную в верхней буферной камере, в нижнюю буферную камеру.

Теперь полностью заполните верхнюю буферную камеру электрофорезным буфером XSDS так, чтобы лунки концентрирующего геля были заполнены буфером. Теперь гель готов к нанесению образцов: с помощью автоматического дозатора на 25 или 100 мкл с наконечниками для нанесения на гель внесите образец белка в одну или несколько лунок, осторожно распределяя его тонким слоем по дну лунок. В контрольные лунки внесите стандарты молекулярной массы.

Также добавьте равный объем 1X SDS-буфера для образцов в любые пустые лунки, чтобы предотвратить растекание содержимого соседних дорожек. Теперь можно приступать к электрофорезу в геле. Для запуска электрофореза подключите источник питания к камере и установите постоянный ток 30 мА для плоского геля толщиной 1,5 мм.

После того как ментоловый синий краситель-маркер достигнет нижней части разделяющего геля, отключите источник питания. По завершении электрофореза слейте буфер и снимите верхнюю буферную камеру вместе с закрепленным в ней «сэндвичем» из геля. Расположите гель таким образом, чтобы порядок лунок с образцами был известен.

Затем извлеките «сэндвич» из верхней буферной камеры и положите его на лист абсорбирующей бумаги или бумажные полотенца. После этого осторожно сдвиньте один из прокладочных разделителей наполовину от края «сэндвича» по всей его длине. Используя открытый разделитель в качестве рычага, аккуратно приподнимите стеклянную пластину, чтобы открыть доступ к гелю.

Извлеките гель из нижней пластины. Отрежьте небольшой треугольник от одного из углов геля, чтобы не потерять ориентацию дорожек во время окрашивания и сушки. Процедура гель-электрофореза завершена.

Теперь гель можно подвергнуть различным процедурам детектирования белков. Мы только что продемонстрировали вам способ разделения белков с помощью гель-электрофореза. На этом все.

Спасибо за просмотр и удачи в проведении вашего эксперимента.