Электрофоретического разделения белков

Отделение отдельных белков от сложных белковых смесей может быть достигнуто с помощью гель-электрофореза в полиакриламидном гель-электрофорезе, также известном как пейдж-белки мигрируют в ответ на электрическое поле через поры в гелевой матрице. Сочетание размера пор геля и размера и формы заряда белка определяет скорость миграции белка. В этом видео мы продемонстрируем метод электрофоретического разделения белков.

Здравствуйте, я доктор Бобул Чакраварти из Протеомного центра Института прикладных наук о жизни им. Кека. Сегодня я покажу вам процедуру проведения 1D гель-электрофореза. Итак, приступим.

Для начала соберите стеклянную пластину аппарата для электрофореза в соответствии с инструкциями производителя, используя две чистые стеклянные пластины и две 1,5-миллиметровые прокладки. Теперь зафиксируйте сэндвич из стеклянной пластины на стойке для литья. Далее приготовьте разделительный раствор геля, который был описан в действующих протоколах.

Добавьте указанное количество 10% аммония на сульфат и смешайте с раствором и осторожно перемешайте. Благодаря высокой концентрации акриламида, дегазация не требуется. С помощью одноразовой пластиковой пипетки объемом 10 миллилитров сразу же нанесите разделительный раствор геля на бутерброд по краю одной из прокладок до тех пор, пока высота раствора между стеклянными пластинами не составит около 11 сантиметров.

Далее с помощью другой пипетки медленно покройте верхнюю часть геля слоем примерно в один сантиметр толщиной насыщенной изобутиловой спиртовой или дистиллированной водой. Сделайте это, аккуратно наложив воду на край одного, а затем другого из распорок дайте гелю полимеризоваться от 30 до 60 минут. При комнатной температуре водная накладка гарантирует, что акриламидный гель полимеризуется в прямую линию.

Как только гель полимеризуется, мы готовы залить стекируемый гель, чтобы залить стекируемый гель. Сначала слейте слой дистиллированной воды, затем промойте одним x tris CL в SDS при pH 8,8. Теперь приготовьте укладку гелевого раствора, как указано в действующих протоколах.

Затем, используя пластиковую пипетку, позвольте укладывающемуся гелевому раствору медленно просачиваться в центр бутерброда по краю одной из прокладок до тех пор, пока высота раствора в бутерброде не составит около одного сантиметра от верхней части пластин. Будьте осторожны, чтобы не ввести пузырьки воздуха в стекирующий гель. После того, как гель будет залит, вставьте тефлоновую расческу 0,75 миллиметра в слой стекируемого гелевого раствора.

Дайте укладывающемуся гелевому раствору полимеризоваться от 30 до 45 минут При комнатной температуре мы теперь готовы к подготовке образцов белка. Для начала приготовления образца белка. Разбавьте часть анализируемого образца белка в соотношении один к одному с двумя буферами для образцов XSDS.

Для разбавленных белковых растворов рассмотрите возможность использования буферной смеси из пяти к одному белкам до шестикратного SDS. Если образец представляет собой осажденную белковую гранулу, растворите белок в 50-100 микролитрах одного буфера для образца XSDS. Теперь нагрейте образцы в течение трех-пяти минут при температуре 100 градусов Цельсия в герметичной винтовой крышке, микроцентрифужную пробирку на водяной бане.

Далее аккуратно снимите тефлоновую расческу, не отрывая края полиакриламидных лунок. После того, как расческа будет снята, промойте лунки одним буфером для электрофореза XSDS. Затем с помощью пипетки заполните лунки одним буфером для электрофореза XSDS.

После того, как лунки будут промыты и заполнены буфером, прикрепите гелевый бутерброд к верхней буферной камере. Следуя инструкциям производителя, заполните нижнюю буферную камеру рекомендуемым количеством одного буфера для электрофореза XSDS. Далее поместите бутерброд, прикрепленный к верхней буферной камере, в нижнюю буферную камеру.

Теперь полностью заполните верхнюю буферную камеру одним буфером для электрофореза XSDS так, чтобы лунки для образцов стекируемого геля были заполнены буфером. Теперь гель готов к загрузке с помощью автоматической пипетки объемом 25 или 100 микролитров с наконечниками для загрузки геля, загрузите образец белка в одну или несколько лунок, осторожно нанеся образец тонким слоем на дно лунок. Загрузка контрольных скважин с молекулярными стандартами.

Кроме того, добавьте равный объем одного буфера для отбора проб XSDS во все пустые скважины, чтобы предотвратить растекание прилегающих полос. Теперь мы готовы начать гель-электрофорез. Чтобы запустить гель, подключите блок питания к ячейке и запустите его на 30 миллипирсах постоянного тока для плитного геля толщиной 1,5 миллиметра.

После того, как ментоловый синий краситель для слежения достигнет дна разделительного геля, отключите блок питания. Теперь, когда гель закончил работать, выбросьте буфер для электрофореза и снимите верхнюю буферную камеру с прикрепленным гелевым сэндвичем. Ориентируйте гель так, чтобы был известен порядок лунок образца.

Затем выньте бутерброд из верхней буферной камеры и разложите бутерброд на листе впитывающей бумаги или бумажных полотенцах. Далее осторожно сдвиньте одну из распорок наполовину от края бутерброда по всей его длине. Используйте открытую распорку в качестве рычага, чтобы открыть стеклянную пластину, осторожно обнажая гель.

Снимите гель с нижней пластины. Отрежьте небольшой треугольник от одного угла геля, чтобы ориентация полосы не потерялась во время окрашивания и сушки. Процедура гель-электрофореза завершена.

Теперь гель можно обрабатывать с помощью различных процедур обнаружения белка. Мы только что показали вам, как разделить белки с помощью гель-электрофореза. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.