Анализ Вестернблот

Иммуноблоттинг, часто называемый вестерн-блоттингом, используется для идентификации в образце белка специфических антигенов, распознаваемых поликлональными или моноклональными антителами. Эта процедура обычно следует за электрофорезом в одном или 2D геле и включает в себя перенос отделенных белков на мембраны нитроцеллюлозы. Инкубация этих мембран с первичными и вторичными антителами, прямо или косвенно конъюгированными с ферментами, и визуализация белковых антигенов на этих мембранах с помощью цветных или флуоресцентных субстратных реакций.

В этом видео мы предоставляем пошаговую демонстрацию процедуры иммуноблоттинга. Здравствуйте, я Шон Галлахер из UVPI и сотрудничаю с протеомным центром здесь, в Институте аспирантуры KE. Сегодня я покажу вам анализ иммуноблоттинга.

Он включает в себя ряд этапов, включая разделение белков, блоттинг белков на мембранах, иммунозондирование и визуализацию с помощью хромогенных и ким-люминесцентных субстратов. Итак, приступим. Перед началом процедуры иммуноблоттинга образцы белка должны быть разделены с помощью электрофореза с использованием одномерных или двухмерных гелей небольшого или стандартного размера.

Подготовьте антигенные образцы и загрузите их в полосы на геле, включите предварительно окрашенный или биотинилированный белок, стандарты молекулярной массы в одну или несколько дорожек геля. Эти белковые маркеры будут переноситься на мембрану и удобно указывать на ориентацию мембраны и размеры белков после иммуноокрашивания. После завершения электрофореза мы готовы к сборке иммуноблоттинга.

Чтобы собрать иммуноблоттинг Сначала разберите гелевый сэндвич и удалите стекающий гель Уравновесьте гель в течение 30 минут При комнатной температуре в буфере для переноса это уравновешивание требуется для предотвращения изменения размера геля во время переноса, пока гель уравновешивается. Начните сборку сэндвича для переноса в лотке, достаточно большом, чтобы вместить пластиковую кассету для переноса с буфером для переноса, чтобы кассета была закрыта. Теперь положите скотч или губку на нижнюю половину пластиковой кассеты для перевода.

Затем возьмите лист фильтровальной бумаги, который был обрезан до того же размера, что и гель. Предварительно смочите его с помощью буфера для переноса и положите сверху на блестящую подушечку для скотча. После 30-минутного уравновешивания геля поместите гель поверх фильтровальной бумаги.

Удалите пузырьки воздуха между гелем и фильтровальной бумагой, осторожно прокатав пробиркой или стеклянным стержнем по поверхности геля. Или вы можете использовать ролик BioRad, который поставляется в комплекте BioRad. Не забывайте использовать перчатки при работе с фильтровальной бумагой, гелями и мембранами.

Масло с рук заблокирует передачу. Далее подготавливаем передаточную мембрану. Обрежьте мембрану до того же размера, что и гель, плюс один-два миллиметра по каждому краю.

Затем медленно поместите мембрану в дистиллированную воду одним краем под углом 45 градусов, вода впитается в мембрану и в конечном итоге намочит всю поверхность. Если его быстро вставить в воду, воздух попадет в ловушку и появится в виде белых пятен на мембране. Белок не будет переноситься на эти участки.

Как только мембрана полностью намокнет, уравновесьте ее в течение 10-15 минут и переведите буфер. Эта процедура смачивания работает для нитроцеллюлозных и нейлоновых мембран. Только мембраны из ПВДФ являются гидрофобными и не намокают просто от помещения в дистиллированную воду или переноса. Буфер.

Мембраны из ПВДФ необходимо сначала погрузить в 100% метанол на одну-две секунды, а затем уравновесить в течение 10-15 минут. В буфере передачи. Ни в коем случае не допускайте пересыхания мембраны.

Если это произошло, смочите еще раз метанолом, а затем передаточный буфер. Как только мембрана будет готова, поместите предварительно смоченную мембрану непосредственно на верхнюю сторону геля. Не забудьте удалить все пузырьки воздуха между гелем и мембраной, аккуратно прокатав пробиркой, стеклянным стержнем или валиком BioRad по поверхности мембраны.

Далее мокрый, еще один кусок фильтровальной бумаги ватмана три мм. Затем поместите его поверх мембраны и снова удалите все пузырьки воздуха. Затем положите поверх этой фильтровальной бумаги еще один скотч или яркую губку.

Завершите сборку сэндвича с иммуноблоттингом, зафиксировав верхнюю половину кассеты для переноса на месте. Теперь, когда бутерброд с иммуноблоттингом собран, мы готовы к переносу белков из геля на мембрану. Чтобы начать процедуру переноса, заполните резервуар для электроблоттинга буфером для переноса и поместите кассету с сэндвичем в аппарат для электроблоттинга.

Важно, чтобы сэндвич был таким, чтобы мембрана была обращена к аноду или положительно заряженной стороне бака. Подключите выводы блока питания к соответствующей анодной и катодной сторонам электроблоттингового аппарата. Этот конкретный блоттер по критерию поставляется с охлаждающим блоком льда.

Теперь электрофоретический перенос белков из геля на мембрану в течение 30-60 минут при 50 вольт с охлаждением или в течение ночи при 14 вольт в холодном помещении. Когда перенос будет завершен, выключите электропитание и разберите аппарат. Затем снимите мембрану с промокательного аппарата и отметьте ориентацию, срезав уголок.

На этом этапе мембраны можно высушить и хранить в закрывающемся пластиковом пакете при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного года. Перед дальнейшей обработкой высушенные мембраны из ПВДФ необходимо поместить в небольшое количество 100% метанола для увлажнения мембраны. Затем в дистиллированную воду удалить метанол.

После того, как ориентация будет отмечена, окрасьте гель, чтобы убедиться в эффективности переноса. Чтобы визуализировать перенесенные белки, вы можете либо обратимо окрашивать мембрану рубином ципро, либо необратимо индийскими чернилами камаси, синим нафтолом или коллоидным золотом. Эти необратимые процедуры окрашивания несовместимы с нейлоновыми мембранами.

Теперь, когда белки перенесены на мембрану, приступайте к иммунозондированию и визуальному обнаружению белков. На этом этапе иммобилизованные белки на мембране зондируются специфическими антителами для идентификации и количественного определения любых присутствующих антигенов. Для начала поместите мембрану в пластиковый инкубационный лоток с блокирующим буфером объемом 20 миллилитров.

Некоторые люди используют пакеты, но вместо них часто используются лотки, поскольку они особенно полезны при обработке большого количества полосок в различных растворах первичных антител. Далее инкубируйте герметичную мембрану в течение 30 – 60 минут при комнатной температуре с перемешиванием на орбитальном шейкере или качающейся платформе. Во время инкубации мембраны разбавляют первичное антитело и блокирующий буфер.

Разведение определяется опытным путем, но обычно составляет от одного к 100 до одного к 1000. Для поликлонального антитела от одного до 10 к одному из 100 для гибридных надосадочных линий и более чем от одного к 1000 для мышиных кислот, содержащих моноклональные антитела. Когда инкубация будет завершена, вылейте блокирующий буфер.

Замените буфер разведенным первичным антителом, и снова инкубируйте от 30 до 60 минут при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Далее промойте мембрану четыре раза, перемешивая со 100 миллилитров. TTBS для фильтров из нитроцеллюлозы или PVDF или TBS для нейлоновых фильтров.

Промывайте в течение 10-15 минут каждый раз, пока промывается мембрана, разбавляйте вторичное антитело в блокирующем буфере. Примерами вторичных антител являются пероксидаза или щелочная фосфатаза хренского редьки, конъюгат против IG, коммерчески доступный фермент конъюгированный. Вторичные антитела обычно разбавляют от одного к 200 до одного до 25 000 перед использованием.

После того, как этапы промывки завершены и промывочные материалы отброшены, добавьте разведенную пероксидазу хрена или щелочную фосфатазу, конъюгат против IG и инкубируйте от 30 до 60 минут при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Через 30-60 минут снимите мембрану с мусорного ведра и промойте его четыре раза, каждый раз по 10-15 минут. В TTBS как описано ранее.

После того, как промывка завершена, мы готовы приступить к этапу визуализации. Но сначала мы продемонстрируем альтернативную процедуру иммунозондирования. Эта альтернативная процедура иммунозондирования основана на наборе векторного окрашивания A BC от Vector Labs.

Он использует комплекс авидана биотина для присоединения пероксидазы хренской редьки или HRPO или щелочной фосфатазы A A P к биотинилированному вторичному антителу. Сегодня мы продемонстрируем комплект HRPO. TTBS хорошо подходит в качестве блокирующего буфера для биотиновых систем avadon.

Но для нейлоновых фильтров рекомендуются реагенты, связывающие белки, потому что обезжиренное сухое молоко содержит остаточный биотин, который будет мешать иммуноанализу. Его необходимо использовать на этапе блокировки только для начала балансировки мембраны в блокирующем буфере в открытом лотке с постоянным перемешиванием с помощью орбитального шейкера или качающейся платформы. Инкубируйте мембрану от 30 до 60 минут при комнатной температуре, пока мембрана уравновешивается.

Приготовьте первичный раствор антитела. Используйте TTBS для мембран из нитроцеллюлозы или PVDF с высокой чувствительностью Aden. Биотиновые системы.

Разведение цера, содержащей первичные антитела, обычно колеблется от одного на 1000 до одного на 100 000. Использование хемилюминесцентной химии требует более широкого диапазона разведений. В нашем случае, демонстрируя хромогенность.

Мы используем разведение первичного препарата один к 5 000. Как только e уравновешивание будет завершено, удалите блокирующий буфер. Затем добавьте достаточное количество раствора первичного антитела, чтобы покрыть мембрану.

Выдержать мембрану в течение 30 минут при комнатной температуре с легким покачиванием через 30 минут. Трижды промойте мембрану в TTBS для нитроцеллюлозы с интервалом в пять минут Во время этапа промывки приготовьте раствор биотинилированного вторичного антитела, разбавив одну каплю биотинилированного антитела 10 миллилитрами TTBS. После того, как этапы промывки будут завершены, добавьте вторичный раствор антител.

Инкубируйте мембрану в течение 30 минут при комнатной температуре с медленным покачиванием, пока мембрана инкубируется со вторичным антителом. Для этого приготовьте биотин авадон HRPO. Смешайте две капли реактива vti для окрашивания А и две капли реактива Б в 10 миллилитрах.

TTBS для нитроцеллюлозы. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, когда инкубация вторичных антител будет завершена. Промойте мембрану три раза в течение 15 минут с помощью TTBS или TBS.

Далее добавьте на мембрану раствор фермента авидана биотина и выдержите 30 минут при комнатной температуре при медленном покачивании. Затем промойте мембрану три раза с интервалом в 10 минут с помощью TTBS. Теперь, когда процедура иммунозондирования завершена, мембраносвязанные белки готовы к визуализации с помощью хромогенных субстратов.

На этом заключительном этапе визуализации субстраты CN dab slash ICL two и TMB обычно используются с процедурами иммунодетектирования на основе пероксидазы хрена. Если окончательная промывка мембраны во время процедуры иммунозонда проводилась в ТТБС, то мембрану промывали в течение 15 минут при комнатной температуре и 50 миллилитров. Теперь TBS помещает мембрану в решение для хромогенной визуализации.

Белковые полосы должны появиться через 10 – 30 минут. После 30-минутной инкубации выбросьте реакционную смесь субстрата и завершите реакцию, добавив дистиллированную воду. Иммуноблоттинг — это многоступенчатая процедура, используемая тысячами лабораторий для определения наличия определенных белков после одно- или 2D-электрофореза.

Я только что показал вам, как проводить иммунологический анализ крови. Вот и все. Удачи в ваших экспериментах и спасибо за просмотр.