Молекулярная эволюция Tre рекомбиназы

Меня зовут Фрэнк Альц. Я руководитель группы в Институте биологии макулярных клеток и генетики Макса Планка в Дрездене. Сейчас я расскажу о нашей работе по созданию сайт-специфических рекомбиназ для молекулярной хирургии.

По сути, это инструмент, позволяющий вырезать определенные, заранее заданные последовательности из генома, а конкретнее — пытаться уничтожить клетки, инфицированные ВИЧ, путем удаления вируса. Таким образом, основной целью является вырезание провируса ВИЧ из генома инфицированных клеток. Другая концептуальная идея заключается в том, чтобы адаптировать уже хорошо изученный генетический инструмент, а именно Cre-рекомбиназу, для связывания, распознавания и использования целевого участка, который мы определяем заранее.

Таким образом, мы поставили перед собой задачу выяснить, можем ли мы создать сайт-специфическую рекомбиназу, которая связывается с участком, естественным образом присутствующим в LTR вируса ВИЧ. Мы предположили, что если это удастся реализовать, то станет возможным вырезать провирус из генома. В целом жизненный цикл вируса включает стадию, на которой вирус интегрируется в клетки, а затем посредством обратной транскрипции создает матрицу ДНК, ограниченную двумя терминальными повторами.

Они называются длинными концевыми повторами или коротко LTR. Затем этот комплекс переносится в ядро и фактически встраивается более или менее случайным образом в геном организма-хозяина. Таким образом, возникает ситуация, когда вы имеете так называемый провирус, который интегрирован в геном и фланкирован двумя длинными концевыми повторами, двумя LTR.

Концепция заключалась в следующем: если мы сможем создать рекомбиназу, распознающую последовательность, существующую в LTR, то мы сможем вырезать провирус в виде кольца из генома хозяина и тем самым уничтожить вирус в клетках. Такова была теоретическая идея. Рекомбиназа фактически представляет собой ДНК-связывающий белок, который находит очень специфический сайт.

Таким образом, он обладает ДНК-связывающим доменом, который распознает определенную последовательность внутри ДНК. Фермент становится активным только тогда, когда находит именно эту последовательность. Он не проявляет активности по отношению к любым другим последовательностям.

Принципы молекулярной эволюции в основе своей известны каждому, поскольку они ничем не отличаются от селекции. Принцип молекулярной эволюции заключается в том, что вы вносите мутации, после чего следует процесс селекции, в ходе которого вы отбираете определенный признак. Это происходит точно так же, как при селекции растений.

Вы знаете, что хотите получить определенный размер или определенный цвет, и затем снова и снова выбираете для следующего поколения потомство с определенными признаками и начинаете скрещивать их между собой. Это в точности то же самое, что мы делаем с молекулами. По сути, это тот же процесс, но в меньшем масштабе.

Мы начинаем с фермента, обладающего определенной активностью — в нашем случае это CRE-рекомбиназа, и с белка дикого типа. Затем мы вносим небольшую мутацию в сайт связывания этой рекомбиназы, в результате чего активность становится очень, очень низкой. После этого мы вносим случайные мутации в фермент (в рекомбиназу) и отбираем мутанты, которые теперь способны связываться с этим мутировавшим сайтом.

Получив это, мы сможем объединить различные мутанты, чтобы в итоге создать конечный продукт, в котором рекомбиназа будет распознавать последовательность, определенную нами в LTR. Как я уже сказал, мы начинаем с библиотеки случайных мутагенов. Обычно это делается с помощью ПЦР с преднамеренным внесением ошибок.

Таким образом, мы используем условия ПЦР, при которых, например, используется Taq-полимераза, допускающая большое количество ошибок. Этим способом мы создаем случайную библиотеку, содержащую мутации по всему объему. Мы также можем использовать мутаторный штамм бактерий, который индуцирует возникновение множества мутаций в определенных транскриптах.

Затем они используются в качестве исходного материала. Другая технология, которую мы применяем, заключается в последующем использовании перетасовки ДНК. По сути, это технология, позволяющая комбинировать различные полезные мутации, поскольку заранее неизвестно, какая именно из мутаций окажется полезной, но при этом имеются разные мутанты с различными мутациями.

Таким образом, у вас есть один ген с полезной мутацией в данном месте. У вас есть второй клон с мутацией в другом месте, и чтобы объединить их, вы проводите случайную фрагментацию различных участков, а затем объединяете их в ПЦР-реакции для повторной сборки продуктов. Теперь с определенной частотой вы получите комбинацию двух вариантов, где часть рекомбинации состоит из первого мутанта, а часть — из второго.

И тогда этот компонент окажет дополнительный эффект, который позволит вам гораздо быстрее отбирать кандидатов с требуемыми свойствами. Таким образом, я бы установил определение, согласно которому белок дикого типа обладает абсолютным отсутствием активности на определенном сайте. Так, если мы возьмем, например, нашу последовательность, выбранную из LTR вируса HIV-LTR, то при применении CRE-рекомбиназы к этой последовательности активность будет полностью отсутствовать.

CRE-рекомбиназа не способна рекомбинировать этот сайт, и, я бы сказал, вы получаете новую рекомбиназу по определению, когда у вас появляется фермент, способный связывать и рекомбинировать эту последовательность. Мы не определяли заранее количество циклов, которые предстояло провести, но мы выполняли столько циклов, сколько было необходимо, пока не получили фермент с требуемой нами активностью. Таким образом, мы начали с очень незначительных мутаций в сайте, а затем стали объединять различные мутации вместе.

Это был один из важнейших этапов, благодаря которому данный процесс сработал. Мы перебирали промежуточные варианты и должны были пройти через множество таких циклов, чтобы найти фермент, обладающий достаточной активностью для перехода к следующему циклу. Это очень похоже на любой процесс селекции.

Вы определяете необходимый уровень активности или конкретный признак, который хотите получить, и начинаете селекцию. И пока вы не добьетесь желаемого результата, процесс продолжается, и вам приходится проводить большее количество поколений. В этом, по сути, и заключается суть метода.

Я также должен отметить, что 120 циклов эволюции, или, если быть точным, сто двадцать восемь, были проведены лишь для того, чтобы найти промежуточный этап, на котором мы могли бы остановиться, обнаружив определенную активность. Рекомбиназы, которые мы имеем на данный момент, все еще менее активны, чем CRE-рекомбиназа дикого типа. Таким образом, для получения более активной рекомбиназы нам потребовалось бы провести больше циклов эволюции.

Таким образом, на данном этапе процесс эволюции фактически не завершается. Я не вижу никаких технических ограничений. Однако остается открытым вопрос о том, насколько далеко можно зайти в этом направлении.

Таким образом, сторона LTR, то есть последовательность, которую вы обнаружите в LTR HA, имеет 50% сходства с природным сайтом locks P — природным сайтом, который распознает рекомбиназа query. Вопрос в том, можно ли пойти еще дальше; мы этого пока не знаем, но тот факт, что мы имеем лишь 50% сходства с сайтом дикого типа, предполагает, что этот предел можно отодвинуть еще дальше. Рекомбиназа хорошо работает в культурах клеток человека, хотя, как я уже сказал, она не столь активна, как рекомбиназа query на своем собственном сайте.

Таким образом, стабильность, вероятно, несколько ниже, чем у исследуемого рекомбиназа, фермента дикого типа, поэтому для улучшения этих характеристик в будущем потребуется более тщательный отбор и большее количество циклов эволюции. Первым шагом станет улучшение данного конкретного рекомбиназа, TRE-рекомбиназы, для повышения его активности; возможно, также стоит найти другие выраженные участки, которые были бы подходящими мишенями в LTR, и подобрать для них оптимальный рекомбиназ. Затем нам потребуется протестировать этот рекомбиназ в различных анализах: сначала снова на культурах клеток, но затем, что крайне важно, проверить действие рекомбиназа на моделях животных.

Таким образом, нам необходимо проверить, вызывает ли эта рекомбиназа какие-либо нежелательные побочные эффекты в организме. И, конечно, весьма сложным аспектом является разработка эффективной системы доставки этой рекомбиназы, что не является тривиальной задачей. Разработка такой системы сама по себе представляет собой целую область исследований.

По сути, нам пришлось бы использовать подход генной терапии. Думаю, мы наблюдаем сдвиг в медицине в сторону все более молекулярного подхода. И для этого, конечно же, нам необходимы инструменты, позволяющие работать на таком уровне.

И именно здесь я вижу будущее процесса эволюции. Нам необходимо создавать специально модифицированные ферменты, которые работают в рамках процесса, который мы действительно хотели бы использовать; в случае с рекомбиназой это можно провести по аналогии с инструментом хирурга, которому в ходе операции необходимо вырезать определенный участок. Таким образом, сейчас нам нужны инструменты, с помощью которых «молекулярный хирург» мог бы специфически вырезать определенный фрагмент ДНК из генома.

И для этого ему необходимы соответствующие инструменты. Таким образом, молекулярная эволюция может фактически выполнять эту функцию. В природе существует множество ферментов, обладающих очень подходящими свойствами для решения этой задачи.

Нам просто нужно адаптировать их под наши нужды, чтобы сделать их полезными. И я считаю, что молекулярная эволюция может сыграть здесь очень важную роль. Трудно сказать, в чем заключаются ограничения на данный момент, так как эта область технологий все еще находится в зачаточном состоянии.

Таким образом, время покажет, в чем заключаются ограничения. Я уверен, что они будут, но на данный момент, по-моему, возможностей больше, чем реальных ограничений.