Интервью: ВИЧ-1 провирусной Иссечение ДНК Использование Evolved рекомбиназы

Меня зовут Джо Э Хвар, и я направляюсь на кафедру клеточной биологии и биологии Высшего института домашних животных в Гамбурге, Германия. HE PET Institute — это фундаментальный научно-исследовательский институт, специализирующийся исключительно на человеческой пе, патогенных вирусах и, да, и связанных с этим вопросах, я бы сказал. Поэтому наш отдел в первую очередь заинтересован в исследовании регуляции экспрессии генов ВИЧ, а также взаимодействия в частности внутриклеточного взаимодействия ВИЧ с компонентами клетки-хозяина.

На основе этих данных мы также пытаемся разработать новые экспериментальные методы лечения ВИЧ-инфекции. Проблема с ВИЧ заключается в том, что ВИЧ является ретровирусом или лентивирусом, и, как и любой ретровирус, ВИЧ интегрируется при инфицировании клетки-хозяина, вирусный геном в геном клетки-хозяина. Пока что избавиться от интегрированного провируса уже не удается.

Это означает, что с точки зрения терапии мы говорим о хроническом заболевании с пожизненной терапией и, в основном, со всеми проблемами, связанными с пожизненной терапией, такими как побочные эффекты лекарств, возникновение резистентности и так далее. Ну, в течение многих лет в фундаментальных исследованиях мы знаем так называемую рекомбиназу, которая естественным образом проявляется в рекомбинациях, таких как дрожжи или бактерии, например. И эти рекомбинации распознаются специфическими последовательностями ДНК и перетасовывают гены, перестраивают геном и так далее.

В частности, одна рекомбиназа, называемая декре-рекомбинацией, используется в фундаментальных исследованиях и на месте в фундаментальных исследованиях. И CRE в основном распознает свою конкретную последовательность. И если у вас есть последовательность, расположенная между двумя сайтами узнавания, CRE может в основном вырезать промежуточную последовательность.

Так что уже 10 или 15 лет назад идея из медицины заключается в том, чтобы искоренить вирус, а с другой стороны, использовать как рекомбиназу как горе, например, для вырезания профиля. ДНК, теоретически это должно быть возможно, потому что при инфицировании ВИЧ осуществляет обратную транскрибацию, его геном RA в ДНК и, благодаря этому процессу обратной транскрипции генерируются последовательности, называемые длинными концевыми повторами, и они отмечают в основном пять бри или начало и границу свободных краев, конец интегрированного профиля D.So в теории. Если бы можно было придумать три рекомбинации, которые распознают бы конкретно в последовательности в LTR, то несогласные в основном атаковали бы пять простых концов и свободный конец BRI интегрированного профиля, вырезали бы ДНК и в основном уничтожили бы вирус из проинфицированной клетки. Проблема с ВИЧ заключается в том, что у нас есть разные изоляты, которые могут быть также в одном человеке, в одном пациенте, однако, как мы знаем до сих пор, последовательность находится в начале и в конце вируса вирусного генома.

Другими словами, LTR более консервативны, чем, например, гены ВИЧ. Так что я думаю, что есть хороший шанс, что мы сможем обойтись всего несколькими цифрами рекомбинации, которые в основном признают огромную зрелость всех изолятов ВИЧ. А если нет, то в основном мы должны создать новую молекулярную эволюцию, которая в будущем может быть частично автотомизирована.

И это будет, процесс будет намного быстрее, чем делать это в лаборатории. В нашем коллеге, докторе Франке из Института Макса Сплунка, подошла к концу картины. По сути, он эксперт по рекомбиназе и всему остальному.

По сути, то, что он использовал, мы называем методом молекулярной эволюции. Но метод основан на технологии полимерной цепной реакции ПЦР. И он берет ген встречающейся в природе рекомбиназы степени гребня и настраивает ПЦР или множественные ПЦР-реакции в условиях, которые случайным образом вносят мутации.

И теперь хитрость заключается в том, чтобы выбрать новые версии рекомбиназы, которые приобрели новую способность или новую активность, а именно распознавание специфических для ВИЧ последовательностей. И он делает это повторяющимися циклами. Он, он, ему понадобилось около 120 или более 120 циклов, чтобы сделать этот молекулярный метод молекулярной эволюции.

Когда он, наконец, придумал эту специфичную рекомбинацию, теперь называемую три для LTR-специфической рекомбинации с этой новой рекомбинацией, которая теперь специфически распознает последовательности ВИЧ. Таким образом, первоначальные исследования здесь были, эксперименты с рекомбинантами проводились здесь, в Институте ПЭТ в Гамбурге. И что мы сделали, в частности, мы доставили эту рекомбинацию с векторами, генными векторами в культуру клеток человека, которая была инфицирована более или менее клиническим изолятом H, HIV V.

И со временем, в течение шести-восьми недель, мы смогли это продемонстрировать. Сейчас рекомбинант интересен количественно, они интегрировали профиль ВИЧ DA, в основном вся культура излечивается путем избавления от ВИЧ. Безусловно, с этой технологией существует множество проблем.

Прежде всего, мы должны убедиться, что экспрессия рекомбиназы не вызывает токсических побочных эффектов. Мы не ожидаем этого, потому что для естественных рекомбинаций, таких как гре, существуют так называемые трансгенные животные. Они экспрессируют эту рекомбинацию GRE и ладно, так что есть некоторые проблемы, но не слишком существенные.

Могу сказать, что это так. Так что есть надежда, что нет никаких токсических побочных эффектов, но вы никогда не знаете, когда вам придется проводить эксперименты. И есть также проблемы, которые мы, возможно, не распознаем с каждым клиническим изолятом, чтобы мы могли избавиться, от доминирующего изолята, изолята ВИЧ у пациента.

Но со временем мы будем выбирать из второстепенных, второстепенных изолятов. Мы не знаем, мы должны проводить эти эксперименты. Кроме того, существует большая проблема с доставкой генов, с векторной технологией.

Мы должны использовать так называемые лентивирусные векторы или также ретровирусные векторы для доставки гена или гена рекомбиназы. Так есть ли побочные эффекты? Есть, вызывают ли эти переносчики токсические эффекты?

Вот и все вопросы, которые у нас есть. Также, мы надеемся улучшить активность гребней. Они, рекомбинация действует быстрее, чем мы видим сейчас, пару недель, активность.

Так что это все открытые вопросы, которые мы должны проработать в ближайшие годы. И в этом, безусловно, и заключается проблема, потому что рекомбиназы недоступны перорально. Так что таблетки не будет, примите таблетку рекомбиназы просто хорошо, и вы избавитесь от вируса.

Итак, размышляя о будущей терапии, мы должны думать о подходах к генной терапии. Так что, возможно, можно представить, что мы выделяем так называемые гемопоэтические стволовые клетки или CD 34-положительные клетки из крови пациентов с ВИЧ-инфекцией. А затем в лаборатории мы вводим ген для гребней в клетки этого пациента.

Наконец, мы повторно вводим, мы повторно вводим пациенту, мы обуздаем, вводим клетки пациента, и теперь они генетически модифицируют клетки пациента в спину того же пациента. Таким образом, иммунная система или кроветворная система пациента со временем, по крайней мере частично, восстанавливается с помощью клеток, которые при заражении ВИЧ они могут избавиться от вируса, потому что теперь они экспрессируют рекомбиназу. Таким образом, вирусная нагрузка у пациента снизится, но качество жизни, безусловно, улучшится.

И мы также можем надеяться, что иммунная система восстанавливается у этих пациентов, по крайней мере, частично. Таким образом, теперь функции, иммунные клетки, которые полностью функционируют, они смогут атаковать оставшиеся долго инфицированные клетки у этих пациентов. Сможем ли мы действительно полностью, полностью искоренить ВИЧ у пациента, мы не можем сказать в настоящее время.