Интервью: ВИЧ-1 провирусной Иссечение ДНК Использование Evolved рекомбиназы

Меня зовут JohE Hvar, я возглавляю отдел клеточной биологии и биологии в институте HE Pet в Гамбурге, Германия. HE PET Institute — это научно-исследовательский институт, специализирующийся исключительно на человеке, патогенных вирусах и, бы сказал, связанных с ними вопросах. Наш отдел в первую очередь заинтересован в исследовании регуляции экспрессии генов HIV, а также взаимодействий, в частности внутриклеточного взаимодействия HIV с компонентами клетки хозяина.

На основании этих данных мы также стремимся разработать новые экспериментальные методы терапии ВИЧ-инфекции. Проблема ВИЧ заключается в том, что ВИЧ является ретровирусом или лентивирусом, и, как любой ретровирус, при инфицировании клетки-хозяина он встраивает вирусный геном в геном клетки-хозяина. На данный момент избавиться от встроенного провируса уже невозможно.

Это означает, что с точки зрения терапии мы имеем дело с хроническим заболеванием, требующим пожизненного лечения, и, соответственно, со всеми проблемами, связанными с длительной терапией, такими как побочные эффекты препаратов, возникновение резистентности и так далее. Уже многие годы в фундаментальных исследованиях нам известны так называемые рекомбиназы, естественным образом участвующие в рекомбинациях, например, у дрожжей или бактерий. Эти рекомбиназы распознают специфические последовательности ДНК, перемешивают гены, перестраивают геном и так далее.

В частности, в фундаментальных исследованиях, в том числе in situ, используется рекомбиназа, называемая Cre-рекомбиназой. Cre распознает свою специфическую последовательность, и если последовательность находится между двумя сайтами распознавания, Cre способна вырезать этот промежуточный участок.

Таким образом, уже на протяжении 10 или 15 лет существует идея в медицине искоренить вирус, используя, например, рекомбиназу Cre для вырезания провирусной ДНК. Теоретически это должно быть возможно, так как при инфицировании ВИЧ осуществляет обратную транскрипцию своего РНК-генома в ДНК, и в результате этого процесса обратной транскрипции образуются последовательности, называемые длинными терминальными повторами (LTR), которые фактически обозначают 5'-конец (начало) и 3'-конец (конец) интегрированной провирусной ДНК. Следовательно, в теории, если бы удалось создать рекомбиназу, которая специфически распознает последовательность в LTR, то Cre фактически атаковала бы 5'-конец и 3'-конец интегрированной провирусной ДНК, вырезала бы ДНК и фактически искоренила бы вирус из инфицированной клетки. Проблема с ВИЧ заключается в том, что существуют различные изоляты, возможно, даже у одного человека, одного пациента, однако, насколько нам известно на данный момент, эта последовательность присутствует в начале и в конце вирусного генома.

Другими словами, LTR более консервативны, чем, например, гены ВИЧ. Поэтому я полагаю, что существует большая вероятность того, что нам будет достаточно всего нескольких вариантов рекомбинант, которые в целом распознают огромное разнообразие всех изолятов ВИЧ. Если же этого окажется недостаточно, нам придется создать новый вариант с помощью молекулярной эволюции, которая в будущем может быть частично автоматизирована.

И это действительно так: процесс пройдет гораздо быстрее, чем при выполнении в лаборатории. В нашем проекте принял участие коллега, доктор Фрэнк из Института Макса Планка. По сути, он является экспертом по рекомбиназе и смежным вопросам.

По сути, он использовал то, что мы называем методом молекулярной эволюции. Этот метод основан на технологии ПЦР — полимеразной цепной реакции. Он берет ген природной рекомбиназы Dre combs и проводит ПЦР или серию ПЦР-реакций в условиях, которые случайным образом индуцируют мутации.

Суть метода теперь заключается в том, чтобы отобрать новые версии рекомбиназы, которые приобрели новую способность или активность, а именно — распознавание специфических последовательностей ВИЧ. Он осуществляет это в повторяющихся циклах. Для проведения такого метода молекулярной эволюции ему потребовалось около 120 или более 120 циклов.

Когда он, наконец, разработал эту специфическую, теперь называемую three for LTR, рекомбиназу с этой новой способностью к рекомбинации, которая теперь специфически распознает последовательности HIV. Таким образом, первоначальное исследование, эксперименты с рекомбиназами, проводились здесь, в Институте HE PET в Гамбурге. В частности, мы вводили эту рекомбиназу с помощью генных векторов в культуру клеток человека, которые были инфицированы, по сути, клиническим изолятом HIV 1.

И со временем, в течение шести-восьми недель, нам удалось это продемонстрировать. Теперь рекомбинант вызывает интерес с количественной точки зрения: они интегрировали профиль HIV DA, и, по сути, вся культура была излечена путем удаления HIV. Безусловно, с этой технологией связано множество проблем.

Прежде всего, необходимо убедиться, что экспрессия рекомбиназы не вызывает токсических побочных эффектов. Мы не ожидаем подобного, так как для естественно происходящих рекомбинаций, таких как gre, существуют так называемые трансгенные животные. У них экспрессируется эта рекомбинация GRE, и, хотя определенные проблемы имеются, они не слишком значительны.

На данном этапе я могу так сказать. Есть надежда, что токсических побочных эффектов не будет, но никогда не знаешь наверняка, пока не проведешь эксперименты. Также существуют проблемы, из-за которых мы, возможно, не сможем распознать каждый клинический изолят, и таким образом не сможем избавиться от доминирующего изолята ВИЧ у пациента.

Однако со временем мы будем отбирать лучшие изоляты из числа незначительных. Поскольку мы этого не знаем, нам необходимо провести данные эксперименты. Кроме того, существует серьезная проблема с доставкой генов и технологией использования векторов.

Для доставки целевого гена или гена рекомбиназы нам необходимо использовать так называемые лентивирусные или ретровирусные векторы. Возникает вопрос: есть ли побочные эффекты? Существуют ли они, и вызывают ли эти векторы токсический эффект?

Это все вопросы, которые у нас есть. Кроме того, мы надеемся повысить активность гребней. Рекомбинация происходит быстрее, чем мы наблюдаем сейчас, в течение последних нескольких недель, в плане активности.

Таким образом, всё это открытые вопросы, над которыми нам предстоит работать в ближайшие годы. И сейчас это определенно является проблемой, поскольку рекомбиназы не доступны для перорального приема. Поэтому никакой «таблетки с рекомбиназой», которую можно было бы просто принять и избавиться от вируса, не существует.

Рассуждая о будущей терапии, нам следует рассмотреть подходы генной терапии. Можно предположить, что из крови пациентов, инфицированных ВИЧ, выделяют так называемые гемопоэтические стволовые клетки или CD34-положительные клетки. Затем в лабораторных условиях в эти клетки пациента вводят ген CCR5.

Наконец, мы повторно вводим, реинфузируем пациенту его собственные генетически модифицированные клетки в ту же область спины. Ожидается, что со временем иммунная или гемопоэтическая система пациента будет хотя бы частично восстанавливаться за счет клеток, которые при инфицировании HIV смогут уничтожать вирус, поскольку теперь они экспрессируют рекомбиназу. Результатом станет снижение вирусной нагрузки у пациента, что, безусловно, улучшит качество его жизни.

Также можно надеяться, что иммунная система этих пациентов восстанавливается хотя бы частично. Таким образом, полностью функциональные иммунные клетки, возможно, смогут атаковать оставшиеся латентно инфицированные клетки у этих пациентов. Можем ли мы действительно полностью, окончательно искоренить ВИЧ у пациента — на данный момент ответить на этот вопрос невозможно.