В пробирке Дифференциация Мышь эмбриональных стволовых (MES) ячеек с использованием висячей капли Метод

Стволовые клетки обладают замечательным потенциалом для развития различных типов клеток в организме. Служит своеобразной ремонтной системой для организма. Теоретически они могут делиться без ограничений для пополнения других клеток.

Когда стволовая клетка делится, каждая новая клетка может либо остаться стволовой клеткой, либо стать другим типом клеток с более специализированной функцией. Эта многообещающая область науки побуждает ученых исследовать возможность клеточной терапии для лечения заболеваний in vitro. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток происходит, когда клеткам позволяют агрегировать в суспензионной культуре.

В отсутствие мышиных эмбрионов, фидеров фибробластов и фактора, ингибирующего лейкоз, эти клеточные агрегаты называются эмбриональными телами. Метод висячих капель является одной из эффективных процедур для дифференцировки стволовых клеток в тела эмбрионов in vitro. Здравствуйте, я Ша Цзюань из отделения сердечно-сосудистой медицины в Стэнфордском университете.

Сегодня мы покажем вам процедуру индивидуальной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток для имритизации организма методом ручного капли. Обычно мы используем этот метод для дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в кардиомиоциты. Эта процедура, включающая следующие этапы, включает в себя приготовление одноклеточной суспензии эмбриональных стволовых клеток, получение культур ручных капель, перенос культур ручных капель на планшеты со сверхнизким уровнем прикрепления и нанесение эмброидных тел на пластины с выступающим покрытием.

Итак, давайте начнем. Первым этапом процедуры является приготовление одноклеточной суспензии эмбриональных стволовых клеток. Поскольку мы культивируем наши недифференцированные эмбриональные стволовые клетки, выращивая их на эмбриональных фибробластах мыши, мы должны отделить клетки и отделить их от фибробластов.

Для этого мы пробуем анизировать клетки с помощью стандартных процедур. После того, как попытка и лечение будут завершены, добавьте среду эмбриональных стволовых клеток мыши для нейтрализации трипсина. Затем перенесите клеточную суспензию в коническую трубку диаметром 15 мил.

Затем разбейте колонии клеток, пипетируя вверх и вниз по дну пробирки, пока не получите тонкую суспензию клеток без видимых комков. Теперь вращайте ячейки со скоростью тысяча оборотов в минуту в течение пяти минут. После вращения клетки отсасываются от суперната и ресуспендируют клетки с 10 милами мышиной ES-клетки. Терпимая.

Перенесите клеточную суспензию в колбу T 75, предварительно закодированную 0,1% желатина, и инкубируйте при температуре 37 градусов с 5% CO2 в течение одного часа. Через час фибробласты прикрепляются к пластине, но стволовые клетки остаются в среде. Пипетируйте среду для сбора стволовых клеток.

Вращайте клетки со скоростью тысяча оборотов в минуту в течение пяти минут и отсасывайте от среды. Затем добавьте еще 10 мил среды для дифференцировки и повторно суспендируйте клетки путем повторного пипетирования до тех пор, пока не образуется тонкая суспензия клеток. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.

Теперь мы готовы культивировать клеточную суспензию методом висячей капли. Чтобы начать культуру висячих капель, используют медиану дифференцировки для разбавления суспензии стволовых клеток до концентрации 500 клеток на 20 микролитров. Затем переверните 150-миллиметровую крышку планшета для культуры тканей.

Затем пипеткой нанесите 20 микролитров клеточной суспензии на внутреннюю поверхность пластины крышки. С помощью многоканального дозатора добавьте 10 мил PBS на пластину. Быстро переверните крышку тарелки и аккуратно положите ее на тарелку, чтобы образовались свисающие капли.

Как только крышка пластины будет на месте, осторожно перенесите пластину в инкубаторную культуру. Клетки не тревожатся в течение двух дней. Как только инкубация будет завершена, мы приступим к переносу культуры подвешенных капель на планшеты со сверхнизким прикреплением.

Через два дня осторожно переверните крышку планшета и затем отасуньте 180 микролитров свежей дифференцировочной среды, и закапайте несколько капель в 96-луночную сверхнизкую пластину для прикрепления. Затем наберите капли пипеткой и перенесите их одну за другой на 96-луночную пластину. Поместите пластины в инкубатор в непотревоженном состоянии в течение трех дней.

Тела эмбриона продолжат расти в форму шара. Когда инкубация будет завершена, мы будем готовы к тарелированию тел эмбрионов. Для того, чтобы помочь телам эмбриона продолжать дифференцироваться.

Перекладываем их на 48 хорошо покрытую желатином пластину. Для этого мы сначала покрываем каждую лунку пластины 300 микролитрами 0,1% желатина. После добавления желатина инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день аспирируйте желатин из 48-луночной пластины. Затем добавьте в каждую по 300 микролитров дифференцировочной среды. Ну а теперь одно за другим перенесем тела эмбриона из 96 лунки в 48 лунки, покрытые желатином.

Обычно мы меняем среду на следующий день, а затем через день для поддержания клеток. Мы используем этот метод для поиска лучших протоколов дифференцировки эмбриональных стволовых клеток. Что касается кардиомиоцитов, мы только что показали вам, как выполнить дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мышей in vitro с использованием культур висячих капель.

Этот метод эффективен, потому что круглое дно висячей капли позволяет агрегировать эмбриональные стволовые клетки, тем самым обеспечивая хорошую среду для формирования тел Эмбри. При проведении этой процедуры важно помнить, что количество эмбриональных стволовых клеток, собранных в висячей капле, можно контролировать, изменяя количество клеток в исходной клеточной суспензии. Ну вот.

Спасибо за просмотр. Удачи в вашем эксперименте.