Name: Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-15T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Узнайте метод микроинъекции для создания трансгенных линий C. elegans с визуализацией флуоресцентных белков in vivo. Этот подход позволяет исследовать экспрессию генов в реальном времени.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы хотим отметить дух сотрудничества всех членов Колдуэлл Lab. Двигательные расстройства исследования в лаборатории была поддержана Бахман-Стросс дистонии и Паркинсона фонд, Соединенные Паркинсона Фонда, американский Паркинсона Болезнь ассоциации, Болезнь Паркинсона Ассоциации Алабама, Майкл Дж. Фокс Фонд исследований болезни Паркинсона, и Undergraduate Research.

Выражение плазмиды Строительство Два плазмид требуются: одна для тканеспецифические экспрессии гена интересов и второй, как селективный маркер трансформации. Экспериментальные плазмиды <ol><li> Выберите промоутер, что выражается в ткани / элемент тип интереса, например, нерва или мышцы конкретных промоутера. Если кто-то выразить нескольких генов в той же ткани, промоутер кассету плазмиды в шлюзе системы (Invitrogen) могут быть использованы. Такой подход позволяет вставлять любой ген интереса ниже по течению от промотора рекомбинационной 4 клонирования. Правило, 2-5 кб предшествующих последовательностей достаточно иметь правильные и точные выражения. </li><li> КДНК гена может быть клонирован двумя способами: <ol><li> Обычные клонирования использованием ферментов рестрикции. </li><li> Для клонирования шлюз, это ПЦР усиливается использованием праймеров, содержащих шлюз ATT B рекомбинационной последовательности. Усиливается кДНК первой объединить в pDONR201 доноров вектора, чтобы создать запись вектор, а затем превращается в E. палочки штамма DH5a. После выбора успешных рекомбинантов и мини-приготовительные изолирования ДНК, вступление вектор объединить в промоутер содержащих назначения вектор для создания выражения плазмиды. Подробности о рекомбинационной клонирования можно получить либо ручной шлюз Invitrogen или в Колдуэлл и соавт. 5. </li></ol></li></ol> Выбор Маркера плазмиды Примеры трансгенных плазмид маркер включают РОЛ-6 или использование мышц стенки тела промоутер UNC-54 для управления флуоресцентными экспрессии белка. Эти плазмиды маркера, как правило, доступны из научно-исследовательского сообщества по запросу. Микроинъекции Элеганс C. Подготовка <ol><li> Выполните выделения ДНК из двух плазмид, которые должны быть введены. Количественно их и смешать в соотношении 1:1 на 50 нг / мкл. </li><li> Подготовка агара лап: <ol><li> Сделайте 2% агарозном раствора в воде, тепло или микроволновой печи до полного растворения. </li><li> Изложить несколько 22 х 50 мм стекла крышка на настольный. </li><li> С помощью пипетки Пастера, поместите каплю расплавленной агарозы на одной обложкой стекло и сразу же место второй стакан крышку над падение на 90 углом к ​​первой. Повторите несколько других стекол крышку. Диаметр уплощенной диск агарозы должна быть в пределах 15-20 мм. </li><li> После агарозном укрепил (это займет всего моментов), снимите крышку стекла и позволяют площадку высохнуть полностью (несколько часов, чтобы на ночь). </li><li> Хранить прокладки в окно стеклянной крышкой при комнатной температуре. </li></ol></li><li> Сделать иглы погрузчиков ДНК решение: Иглы погрузчики создаются из 100 мкл капиллярной трубки, которые нагреваются в среднем на открытом огне и быстро вытащил примерно в два раза их длины. Две половинки привязываются друг от друга раз капиллярная трубка охлаждается. Запасами 10-20 иглы погрузчики для инъекций. Магазин в вертикальном положении в стойку трубки микроцентрифужных. Будьте осторожны, чтобы не прокалывать себе на очки. </li><li> Сделать микроинъекции игл: Игла изготовлена ​​из специального капилляра, который содержит внутренние нити стекла, нити этого служит фитиля для раствора ДНК. Эти тянут на иглу-съемник машины. Мы используем Narishige PP-830 Съемник с тепловой установки 24.8. Некоторые иглы потянул время и хранятся в небольшой пластиковой коробке. Несколько иглы могут быть легко «установлена» на полосу пластилин для долгосрочного хранения. </li><li> Иглы &quot;выключатели&quot;: Кончике иглы микроинъекции вытягивается так хорошо, что это фактически закрыта в конце этого и должен быть взломан с помощью небольших осколков покровного стекла. Эти подготовленные упаковки 18 х 18 мм защитное стекло в бумажное полотенце и осторожно нажимая пока он разбивается на несколько частей. Осколки полезных размер примерно 3 х 4 мм. </li><li> Расти дикого типа (N2) червей ранней стадии взрослой для инъекций с использованием стандартных процедур 6. Подготовка около 100 правильно поставил черви / построить вводили. </li></ol> Процедура <ol><li> Откройте основной клапан на бак гелия, который подключен к руке микроинъекции иглой и держателем. Закройте регулирующий клапан, чтобы газ, чтобы войти в линию, в результате чего давление до 35 атм. Обратите внимание, что газ может быть выпущен использованием педали. </li><li> Вставьте иглу погрузчика в стандартной трубы pipetter рот (находится в контейнерах стеклянные капилляры) и составить небольшое количество смеси плазмиды (~ 1 мкл). </li><li> Иглы погрузчика осторожно помещают в задней части инъекционной иглы и аккуратно вставляется весь путь до конца длинуиглу, пока не почувствуете сопротивление. Выгнать раствора ДНК, мягко дует, а затем удалить загрузчик. </li><li> Вставьте иглу в микроинъекции руку, стараясь, чтобы поместить его в небольшой внутренний резиновую прокладку. </li><li> Место иглы нарушение осколок покровного стекла на одном краю агар площадку. Обложка осколок, а также всей поверхности агара площадку, с галоидоуглеводородов нефти. Место агар накладка на стадии инвертированного микроскопа. </li><li> Расположите иглу в центр поля зрения использования 4X объективных и яркое освещение поля, но до сих пор не опустите его в масло. Кроме того, положение внутреннего края осколок покровного стекла в центре, затем сосредоточиться на нем (еще используют 4X цель). Опустите иглу в нефти, приведение его в той же фокальной плоскости, как осколок покровного стекла. Поднимите увеличение за счет перехода на 40Х цели. Переориентация на краю осколка и положение кончика иглы, если это необходимо. </li><li> Чтобы открыть до кончика инъекционной иглой, осторожно подталкивать иглу к краю покровного стекла осколок, и в то же время применение короткого импульса газа через ножную педаль. Иглы будет достаточно взломан, когда маленькие капельки жидкости побега конце иглы. Избыток жидкости потока из-за слишком большого открытия не желательно, так как он будет убивать животных. </li><li> Удалить агар площадку со сцены, поднимая иглу, но не меняют X-или Y-ось позиции. Слайд этапе из-под иглы, удалить агар площадку и разместить его на вскрытии микроскопом. Передача червя на панель, ниже поверхности нефти. Если червь извивается, нежно поглаживать его, пока он контактов агар площадку. Влажной червь должен придерживаться сухой агарозы. </li><li> Инъекция <ol><li> Быстро место обратно агар площадку на сцену, центрирования червя в поле зрения. </li><li> Опустите иглу в той же плоскости, в фокусе, как червь. </li><li> Переключатель фильтров для освещения Хоффман (тип контраста фильтра). Это позволяет морфологическая деталь червя становятся видимыми. Если Номарского / DIC оптики можно найти на перевернутый масштаб, который будет работать также. Использование 40X цели, сосредоточиться на &quot;зернистым&quot; синцитиальный центре червь гонады, ниже &quot;сотовый&quot; узор ростка ядер (выбрать в зависимости от того гонады расположен на стороне червя перед иглой). </li><li> Точная настройка положения иглы до кончика также находится в фокусе (той же плоскости, гонад &quot;зернистости&quot;). </li><li> Осторожно введите иглу в центре гонады и применять короткого импульса давления газа изгнать капля или две ДНК в гонады руку. Вы должны наблюдать волну жидкости распределены по дистальной гонады. Не думайте, что больше жидкости, лучше, так как слишком много жидкости может поступать в проксимальных изгиб гонады руки, которые могут закрыть ооцитов производства. Если это возможно, в зависимости от положения червя, ввести другую руку гонады в том же порядке. </li><li> Важно, чтобы работать быстро, в результате употребления инъекционных червя, так как она может легко пересушивает. Решение придать второе плечо гонад зависит от того, насколько быстро вы можете повторно положение иглы и червя. Весь процесс в идеале должны принимать не более 1-2 минут. </li></ol></li><li> Снимите крышку стекла со сцены и поместите его на вскрытии области. Применять 1 мкл М9 буфера (22 мм KH 2 PO 4, 42мм Na 2 HPO 4, 85 мм NaCl, 1 мМ MgSO 4) непосредственно на вводили червя (это может повлечь за собой погружение кончика пипетки от поверхности галоидоуглеводородов нефти). Буфер должен увлажняет червя, он будет плавать от поверхности агарозном площадку. Передача червя регулярные пластины с использованием червя выбор. Площадку агарозы можно повторно использовать еще несколько раз, пока не стало слишком насыщенным буфера и червей не придерживаться. </li></ol> Трансгенные выбор <ol><li> Введенный червей, P 0 поколения, перечисляемых на индивидуальные свежие, бактериально посеяны пластины (60 мм) и позволила воспроизвести. Как правило, вводят животным инкубируют при 20 ° С в течение 2-3 дней, пока потомство появится. </li><li> F 1 потомства наблюдаются на наличие трансгенной маркер (например, флуоресценции) при помощи флуоресцентного стереомикроскопа. Каждый люминесцентные, перевозчик F 1, животное отдельно клонирована на новую пластинку (так как потомство от каждого F 1 рассматриваются различные линии). F 1 гермафродитов допускаются к размножению. Опять же, это, как правило, осуществляется на при 20 ° С в течение 2-3 дней, пока потомство появится. </li><li> F 2 поколения наблюдается у трансгенных животных, а также. F 2 животных, которые унаследовали и выразить трансгенных массива считаются «стабильный» линии. ПРИМЕЧАНИЕ: В F 1-йвозраст может быть много трансгенных животных, но они не являются стабильными. Большинство F 1 трансгенных животных, не будут распространяться на F 2 устойчивых линий. ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля за изменчивости числа копий гена, создавать не менее трех независимых стабильных линий на построить вводили. </li><li> Каждый независимый стабильный линия должна быть сохранена в качестве отдельной строкой червей. Каждая строка может распространяться путем передачи нескольких трансгенных животных для новой пластинкой в ​​каждом поколении, что должно быть выполнено с использованием флуоресцентного стереомикроскопа если выбор маркера флуоресцентные. </li></ol>

<ol><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li>
<li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

При выполнении этой процедуры, важно помнить, чтобы: - Вводят непосредственно в центре гонады - Не вводить слишком много жидкости - Работать быстро, чтобы предотвратить высыхание. Если у вас возникли проблемы с иглой, такие, как он сломан слишком большой, то лучше переделать свежей иглы, а не пытаться внедрить с далеко не идеальным иглы. Поколение трансгенных червей имеет множество применений, таких как: - Выявление мутантных генов, в метод преобразования спасения - Отображение белковых дом...

<table><tbody><tr><td>Агароза</td><td>Ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Галоуглеродное масло, Voltalef</td><td>Hulle 10S</td><td>elfatochem, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Покрывное стекло 18x18 мм</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>Покрывное стекло 20x30 мм</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>Покрывное стекло 22x50 мм</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Капилляр 100 ul</td><td></td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Стеклянный капилляр для игл</td><td>&quot;Kwik-Fil&quot;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Вытягиватель игл</td><td>Инструмент</td><td>Narishige International</td><td>Модель PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Система microINJECTOR</td><td></td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1000</td><td>Окуляр, предметный столик, манипулятор</td></tr><tr><td>Диссекционный, с флуоресценцией</td><td>Микроскоп</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Диссекционный</td><td>Микроскоп</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr></tbody></table>

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс c. Использование Микроинъекция

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Трансгенные Caenorhabditis Элеганс может быть легко создан с помощью микроинъекции ДНК плазмиды раствора в гонады 1. ДНК плазмиды перестраивает сформировать внехромосомными concatamers, которые стабильно наследуются, хотя и не с такой же эффективностью, как фактическое хромосомы 2. Интересующего гена совместно вводили очевидным фенотипических маркеров, таких как РОЛ-6 или GFP, чтобы отбор трансгенных животных при вскрытии микроскопом. Экзогенного гена может быть выражена от его родного промоутер для сотовых исследования локализации. Кроме того, трансгенов может быть вызвано различными тканеспецифические промоутер для оценки роли продукта гена в данной клетки или ткани. Этот метод эффективно диски экспрессии генов во всех тканях C. Элеганс, за исключением половых или раннего эмбриона 3. Создание трансгенных животных широко применяется для целого ряда экспериментальных парадигм. Это видео демонстрирует микроинъекции процедуры для создания трансгенных червей. Кроме того, подбор и обеспечение стабильной трансгенных C. Элеганс линии описывается.

Это видео демонстрирует технику микроинъекции в гонаде C. Элеганс для создания трансгенных животных.

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Трансгенных *Caenorhabditis elegans* можно легко создать с помощью микроинъекции раствора плазмидной ДНК в гонаду 1. Плазмидная ДНК перестраивается в...

Sea elegans является невероятно полезным модельным организмом благодаря как нашим знаниям о его клеточных линиях, так и огромному количеству информации, полученной в результате секвенирования и анализа всего его генома. В этом видео мы демонстрируем процесс микроинъекции плазмид в sea elegans и селекцию трансгенного потомства с помощью флуоресцентной микроскопии; поскольку sea elegans является прозрачным многоклеточным животным, он идеально подходит для визуализации трансгенов, экспрессирующих флуоресцентно меченые белки in vivo. Здравствуйте, меня зовут Лора Берковиц, я научный сотрудник лаборатории Колдвелла на факультете биологических наук здесь, в Университете Алабамы.А я — Адам Найт, также из лаборатории Колвелла в Университете Алабамы. Сегодня я покажу вам, как подготовиться к микроинъекции плазмид и провести её для создания трансгенных *C. elegans*, а также расскажу, как отбирать и поддерживать линии трансгенных *C. elegans*. Итак, приступим.Прежде чем приступить к микроинъекции, необходимо выполнить несколько подготовительных этапов, которые я сейчас продемонстрирую. Сначала подготовьте плазмидную ДНК для инъекции; потребуются две плазмиды: одна, кодирующая тканеспецифическую экспрессию нашего целевого гена, и вторая, содержащая селективный маркер трансформации. Смешайте плазмиды в соотношении один к одному, чтобы итоговая концентрация составляла 50 ng/µL.Затем подготовьте специальные подложки, которые будут использоваться для иммобилизации червей перед инъекцией. Чтобы изготовить такие подложки, сначала разложите на рабочем столе несколько покровных стекол размером 22 × 50 мм. С помощью пастуральной пипетки нанесите каплю расплавленного 2% агарозы на одно покровное стекло и немедленно накройте каплю вторым покровным стеклом, расположив его под углом 90 градусов к первому.Дайте аэрогелю затвердеть в течение нескольких секунд, после чего снимите верхнее покровное стекло. Диаметр сплющенного диска аэрогеля должен составлять от 15 до 20 миллиметров. Оставьте подушечку до полного высыхания на воздухе в течение нескольких часов или на ночь.После высыхания храните планшеты в коробке для покровных стекол при комнатной температуре. Затем подготовьте иглы-загрузчики для раствора ДНК. Для этого возьмите капиллярную трубку объемом 100 µL, нагрейте её посередине в открытом пламени и резко вытяните примерно до удвоенной длины.После охлаждения капиллярной трубки разломите ее пополам. Подготовьте запас из 10–20 игл-загрузчиков для инъекций. Их можно хранить вертикально в микроцентрифужной пробирке.Брэк, будь осторожен. Острия загрузчика игл очень острые. Теперь изготовь иглы для микроинъекций.Данные иглы изготовлены из специальной капиллярной трубки, содержащей внутреннюю стеклянную нить. Эта нить служит фитилем для раствора ДНК. Для изготовления игл используется вытяжной прибор Niki PP eight 30 Polar; при температурном режиме 24.8 за один раз вытягивается несколько игл для последующего хранения.Несколько игл можно закрепить на полоске моделирующего пластилина. Для разлома кончика вытянутой иглы будут использоваться небольшие осколки покровного стекла. Эти осколки подготавливают, обернув покровное стекло размером 18 на 18 миллиметров салфеткой Kim wipe и осторожно нажимая на него до тех пор, пока оно не разобьется на несколько частей.Используйте осколки размером примерно три на четыре миллиметра. Помимо подготовки ДНК и игл, подготовьте около 50–100 червей соответствующей стадии развития. Для каждого экспрессионного вектора, который будет введен, необходимо подготовить по две червя дикого типа.Теперь мы готовы к настройке микроинъекционного микроскопа. Для начала настройки микроскопа откройте главный вентиль на баллоне с гелием, который подключен к манипулятору и держателю иглы для микроинъекций. Закройте регулятор, чтобы газ поступил в линию.При давлении 35 PSI газ можно выпускать с помощью ножной педали. Затем вставьте загрузочное устройство для иглы в трубку стандартного автоматического дозатора и наберите небольшое количество смеси плазмид, примерно один микролитр. Теперь осторожно вставьте загрузочное устройство через иглу для микроинъекций до появления сопротивления.Осторожно выдуйте раствор ДНК и извлеките загрузочное устройство. После загрузки ДНК вставьте иглу в рычаг микроинъектора, стараясь поместить ее внутрь небольшой внутренней резиновой прокладки, а затем закрепите ее зажимом на рычаге манипулятора. Затем поместите осколок покровного стекла для обломки иглы на один край подложки.Покройте осколок, а также всю поверхность предметного стекла для навесного препарата, углеродным маслом. Затем поместите стекло на предметный столик инвертированного микроскопа. Когда стекло будет установлено, с помощью объектива Forex и освещения в светлом поле центрируйте иглу в поле зрения, но пока не опускайте ее в масло.Затем расположите внутренний край осколка покровного стекла в центре и сфокусируйтесь на нем. Опустите иглу в масло, приведя ее в ту же фокальную плоскость, что и осколок покровного стекла. Увеличьте увеличение, переключившись на объектив 40 x, затем снова сфокусируйтесь на крае осколка и при необходимости измените положение кончика иглы.Теперь разломите кончик инъекционной иглы. Осторожно прижмите иглу к краю осколка покровного стекла, одновременно подав короткий импульс газа с помощью ножной педали. После этого кончик иглы будет достаточно разломан.Нежелательно, чтобы из конца иглы выходили мелкие капли жидкости из-за слишком большого потока, так как это приведет к гибели животных. После подготовки иглы мы приступаем к микроинъекции. Затем поднимите иглу вверх, чтобы снять подушечку с яйцами из-под объектива.При этом не изменяйте положение по осям X или Y. Выдвиньте предметный столик из-под иглы. Снимите подложку со шнеком и поместите её под диссекционный микроскоп.Перенесите червя на подушечку под слой масла. Если червь извивается, осторожно погладьте его, пока он не коснется поверхности подушечки; влажный червь должен прилипнуть к сухой поверхности. Быстро поместите подушечку обратно на предметный столик, центрируя червя в поле зрения.Затем опустите иглу в ту же плоскость фокуса, в которой находится червь. Переключите фильтры на инвертированном микроскопе на освещение по Хоффману. Этот контрастный фильтр позволяет визуализировать морфологические детали червя.Используя объектив 40x, сфокусируйтесь на зернистом сенсорном центре гонады червя, расположенном ниже сотового рисунка герминативных ядер. Выберите ту гонаду, которая находится со стороны иглы. Точно отрегулируйте положение иглы, пока ее кончик также не окажется в фокусе.Осторожно введите иглу в центр гонады и подайте короткий импульс давления газа, чтобы вытеснить одну или две капли ДНК в плечо гонады. При наличии достаточного опыта и навыка вы должны наблюдать волну жидкости, распространяющуюся по дистальной части гонады. Вы сможете каждый раз попадать точно в центр гонады.Помните, что при проведении инъекции червя важно работать быстро, так как он может легко пересохнуть. В идеале весь процесс должен занимать менее одной-двух минут.После завершения инъекции снимите подложку с винтовым зажимом со столика и поместите ее под диссекционный микроскоп. Нанесите 1 µL буфера M9 непосредственно на инъецированного червя. Для этого может потребоваться погрузить кончик пипетки ниже поверхности галокарбового масла.Буфер должен регидратировать червя, после чего он отделится от поверхности аэрозольной подушки; перенесите червя на обычный планшет с помощью зонда для червей. Теперь я передам инъецированных червей Адаму, и он продемонстрирует нам процесс селекции и поддержания трансгенных линий. Инъецированные черви переносятся на индивидуальные свежие чашки диаметром 60 мм с питательной средой, где им дают размножиться.Эти черви представляют собой поколение P0. Обычно инъецированных животных инкубируют при 20 °C в течение двух-трех дней до появления потомства. После появления потомства можно приступать к скринингу трансгенных червей.Потомство F1 наблюдают на наличие трансгенного маркера. В данном случае селективный маркер является флуоресцентным, поэтому скрининг можно проводить с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Каждое флуоресцентное животное-носитель F1 отдельно клонируют на новую чашку.Введенная особь P0 может дать от одной до пяти флуоресцентных потомков среди всего поколения F1. Позвольте гермафродитам F1 размножаться при 20 °C в течение двух-трех дней до появления потомства. После того как поколение F2 будет готово, в нем также проводят поиск трансгенных животных. Животные F2, которые унаследовали и экспрессировали трансгенный маркер, считаются стабильной линией.Каждую независимую стабильную линию следует поддерживать как отдельную линию червей; размножайте каждую линию, перенося несколько трансгенных животных на новую чашку в каждом поколении. Это необходимо выполнять с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Если селективный маркер является флуоресцентным, для контроля вариабельности числа копий гена создайте минимум три независимые стабильные линии для каждого введенного конструкта.Мы только что продемонстрировали вам способ микроинъекции экспрессионных векторных конструкций, методы визуализации и отбора стабильных линий. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.

generation-of-stable-transgenic-c-elegans-using-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Трансгенные черви обычно используются...

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

Способность производить трансгенов...

Производство С. Элеганс Трансгенов через Recombineering с GalK Выбор маркера

В модельных организмов, трансгенез может манипулировать функций генов в то время как РНК-интерференции может нокдаун конкретных стенограммы мРНК 1-2. Этот протокол направлен на иллюстрации методов, необходимое для внедрения стабильно передается ДНК и переходные двухцепочечной РНК в necromenic...

RNAi опосредованного Нокдаун гена и трансгенез по Микроинъекция в Necromenic нематода Pristionchus расШсиз</em

В этом видео описывается микроинъекция, распространенный метод создания трансгенных штаммов C. elegans. В примере мы увидим, как микроинъекция используется для введения комплекса рибонуклеопротеинов (RNP) для редактирования генов на основе CRISPR.

Микроинъекция гонад: метод доставки соединения непосредственно в зародышевую линию C. elegans

Этот протокол описывает быструю и малозатратную процедуру интеграции трансгенных экстрахромосомных массивов в геном Caenorhabditis elegans с использованием ультрафиолетового (УФ) облучения. Кроме того, этот протокол особенно хорошо подходит для трансгенных линий, которые передают внехромосомные матрицы с высокой скоростью.

Экспресс-протокол для интеграции внехромосомных матриц с высокой скоростью передачи в геном C. elegans

C. Элеганс обычно выращивают на твердых пластин агара или в жидких культурах затравку Е. палочка. Для предотвращения бактериальных побочных продуктов от оправдав токсикологические и пищевые исследования, мы использовали в аксенными жидкую среду, CeHR, расти и синхронизировать большое количество червей для целого ряда последующих применений.

Культивирование Caenorhabditis Элеганс В аксенными жидких сред и создания трансгенных червей бомбардировки микрочастицами

Микроинъекция ооцитов мыши обычно используется как для классического трансгенеза ( т. Е. Для случайной интеграции трансгенов), так и для CRISPR-опосредованного гена. В этом протоколе рассматриваются последние разработки в области микроинъекции с особым акцентом на стратегии контроля качества и генотипирования.

Генерация генетически модифицированных мышей посредством микроинъекции ооцитов

Используя креплению Cas9 рибонуклеопротеида комплекс (RNP) является мощный метод для изменения генома точный и эффективный. Здесь мы подчеркиваем свою полезность в широком диапазоне клеток и организмов, включая первичных клеток человека и оба классических и новых модельных организмов.

Расширение редактирования с Cas9 рибонуклеопротеида в различных клеток и организмов геном

Здесь мы представляем метод инженер генома C. elegans используя ТРИФОСФАТЫ-Cas9 ribonucleoproteins и гомологии зависимых ремонт шаблоны.

Быстрое и поверхностным трубопровода для генерации геномной мутантов точки в C. elegans с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 Ribonucleoproteins

Функциональный геномный инструментарий для паразитических нематод Strongyloides stercoralis и Strongyloides ratti включает трансгенез, CRISPR/Cas9-опосредованный мутагенез и RNAi. Этот протокол продемонстрирует, как использовать внутригонадную микроинъекцию для введения трансгенов и компонентов CRISPR в S. stercoralis и S. ratti.

Генерация трансгенов и нокаутов у видов стронгилоидов путем микроинъекции

Процесс микроинъекций CRISPR/Cas9 для эндогенного флуоресцентного метирования в зародышевой линии Caenorhabditis elegans с целью получения гомозиготных «knock-in» линий для анализа локализации белков in vivo.

Эндогенное флуоресцентное метирование генов, специфичных для зародышевой линии, опосредованное CRISPR/Cas9 у Caenorhabditis elegans

Узнайте метод микроинъекции для создания трансгенных линий C. elegans с визуализацией флуоресцентных белков in vivo. Этот подход позволяет исследовать экспрессию генов в реальном времени.

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Больше видео