Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Морская элегантность является невероятно полезным модельным организмом как благодаря нашим знаниям о его клеточных линиях, так и благодаря богатству информации, полученной в результате секвенирования и анализа всего его генома. В этом видео мы демонстрируем процесс микроинъекции плазмид в море элегантность и отбор трансгенного потомства с помощью флуоресцентной микроскопии в качестве прозрачного и многоклеточного животного, морская элегантность идеально подходит для визуализации трансгенов, экспрессирующих флуоресцентно меченые белки in vivo. Здравствуйте, меня зовут Лаура Берковиц, и я научный сотрудник в лаборатории Колдуэлла на факультете биологических наук здесь, в Университете Алабамы.

Меня зовут Адам Найт, я тоже из лаборатории Калвелла в Университете Алабамы. Сегодня я покажу вам, как подготовиться и выполнить микроинъекцию плазмина для создания трансгенной морской элегантности, а также покажу вам, как выбрать и поддерживать линии трансгенной элегантности. Итак, приступим.

Прежде чем мы начнем микроинъекцию, у нас есть несколько подготовительных шагов, которые я покажу вам сейчас. Во-первых, для подготовки плазмидной ДНК к введению необходимы две плазмиды, одна из которых кодирует тканеспецифичную экспрессию интересующего нас гена, а вторая обеспечивает селективный маркер трансформации. Смешайте плазмиды вместе в соотношении один к одному 50 нанограмм на микролитр.

Каждый следующий подготавливайте накладки шнека, которые будут использоваться для обездвиживания червей для инъекций. Для изготовления накладок шнека сначала устанавливают несколько защитных стекол размером 22 на 50 миллиметров на столешнице. С помощью пастбищной пипетки поместите каплю расплавленного 2%-ного агроса на одно покровное стекло, а поверх капли сразу же поместите второе покровное стекло под углом 90 градусов к первому.

Дайте аэродинамику застыть в течение нескольких секунд, а затем снимите верхнее покровное стекло. Диаметр сплющенного диска аэрометра должен составлять от 15 до 20 миллиметров. Как домашнее животное, дайте подушке полностью высохнуть на воздухе в течение нескольких часов или на ночь.

Как только они высохнут, храните прокладки в стеклянной коробке при комнатной температуре. Далее подготовьте загрузчики игл для раствора ДНК. Для этого возьмите сотню микролитров капиллярной трубки и нагрейте ее в середине открытого пламени и быстро натяните примерно в два раза длиннее.

Как только капиллярная трубка остынет, разорвите две половинки. Запасите от 10 до 20 игольчатых погрузчиков для инъекций. Вы можете хранить их в вертикальном положении в микроцентрифужной пробирке.

Брэк, будь осторожен. Наконечники игольчатого погрузчика очень острые. Теперь сделайте микроинъекционные иглы.

Эти иглы изготавливаются из специальной капиллярной трубки, которая содержит внутреннюю стеклянную нить. Эта нить служит фитилем для раствора ДНК. Для изготовления игл мы используем Niki PP eight 30 Polar С нагревом 24,8, несколько игл вытягиваются за один раз для хранения.

На полосу пластилина можно установить несколько игл. Маленькие осколки покровного стекла будут использованы, чтобы разбить вытянутый кончик иглы. Эти осколки готовятся путем обертывания покровного стекла размером 18 на 18 миллиметров салфеткой Kim и осторожного надавливания, пока оно не разобьется на несколько частей.

Используйте осколки размером примерно три на четыре миллиметра. В дополнение к подготовке ДНК и игл, подготовьте от 50 до 100 правильно поставленных веществ. Два червя дикого типа для каждой конструкции вектора экспрессии, которую нужно внедрить.

Теперь мы готовы к установке микроинъекционного микроскопа. Чтобы начать настройку микроскопа, откройте главный клапан на гелиевом баллоне, который соединен с рычагом иглы для микроинъекций и держателем. Закройте регулятор, чтобы газ попал в магистраль.

Доведя давление до 35 фунтов на квадратный дюйм, газ можно выпустить с помощью ножной педали. Далее вставьте игольчатый загрузчик в стандартную трубку пипеттера и капните небольшое количество плазмидной смеси примерно на один микролитр. Теперь аккуратно вставьте загрузчик до упора через иглу для микроинъекций, пока не почувствуете сопротивление.

Выдавите раствор ДНК путем осторожного обдува, а затем снимите загрузчик. После того, как ДНК загружена, вставьте иглу в руку для микроинъекций, осторожно поместив ее в маленькую внутреннюю резиновую прокладку, а затем прижмите ее к руке манипулятора. Далее поместите осколок покровного стекла с разбивающейся иглой на один край накладки шнека.

Покройте осколок, а также всю поверхность накладки шнека углеродистым маслом. Затем поместите накладку шнека на предметный столик перевернутого микроскопа. После того, как накладка шнека будет на месте, расположите иглу в центре поля обзора с помощью объектива Форекс и яркой подсветки поля, но пока не опускайте ее в масло.

Далее расположите внутренний край осколка покровного стекла в центре, а затем сфокусируйтесь на нем. Опустите иглу в масло, выведя ее в ту же фокальную плоскость, что и осколок покровного стекла. Увеличьте увеличение, переключившись на объектив 40x, затем снова сфокусируйтесь на краю осколка и при необходимости измените положение кончика иглы.

Теперь сломайте Откройте кончик инъекционной иглы. Осторожно прижмите иглу к краю осколка покровного стекла, одновременно подавая короткий импульс газа через ножную педаль. Игла будет достаточно разбита.

Когда мелкие капельки жидкости выходят из конца иглы, из-за слишком большого количества жидкости отверстие не желательно, так как это приведет к гибели животных. Как только игла готова, мы начинаем микроинъекцию. Далее снимите накладку шнека со сцены, подняв иглу вверх.

Но не меняйте положение оси X или Y. Выдвиньте предметный столик из-под иглы. Снимите накладку шнека и поместите ее на препарирующий микроскоп.

Нанесите слово на прокладку под поверхностью масла. Если червь извивается, то аккуратно поглаживайте его до тех пор, пока он не соприкоснется с накладкой шнека, то влажный червь должен прилипнуть к сухому агро. Быстро поместите накладку шнека обратно на сцену, центрируя червячка в поле зрения.

Затем опустите иглу в ту же плоскость фокуса, что и червь. Переключите фильтры на перевернутом эндоскопе в положение подсветки Гофмана. Этот контрастный фильтр позволяет увидеть морфологические детали червя.

Используя объектив 40x, сосредоточьтесь на зернистом сенсорном центре гонады червя, расположенном ниже сотового рисунка ядер зародышевых ядер. Выберите ту гонаду, которая расположена на стороне червя, обращенной к игле. Штраф. Настраивайте положение иглы до тех пор, пока кончик также не окажется в фокусе.

Осторожно введите иглу в центр гонады и надавите коротким импульсом газа, чтобы вытолкнуть одну или две капли ДНК в плечо гонады. Вы должны наблюдать за волной жидкости, растекающейся по дистальному отделу горла, с большой практикой и мастерством. Вы можете каждый раз попадать в центр поощрения.

Имейте в виду, что во время инъекции червя важно работать быстро. Так как он может легко высохнуть. В идеале весь процесс должен занимать не более одной-двух минут.

Как только впрыск будет завершен, снимите накладку шнека со столика и поместите ее на препарирующий эндоскоп. Нанесите один микролитр буфера M nine непосредственно на введенного червя. Это может повлечь за собой погружение наконечника пипетки под поверхность масла гало-карбюратора.

Буфер должен регидратировать червя, а затем он всплывет с поверхности аэродинамической площадки, перенеся червя на обычную пластину с помощью червячной кирки. Теперь я передам введенных червей Адаму, и он покажет нам выбор и поддержание трансгенных линий. Введенных червей переносят на отдельные свежезасеянные 60-миллиметровые пластины и дают им размножаться.

Эти черви представляют поколение P zero. Обычно инкубированных животных инкубируют при температуре 20 градусов Цельсия в течение двух-трех дней до появления потомства. Как только появится потомство, мы будем готовы начать скрининг на трансгенных червей.

Потомство F1 наблюдается на наличие трансгенного маркера. В этом случае выбираемый маркер является флуоресцентным, поэтому мы можем провести скрининг с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Каждое животное-флуоресцентный носитель F1 отдельно клонируется на новую пластину.

Введенный P-ноль может произвести только от одного до пяти флуоресцентных потомков из всего F1. Дайте гермафродитам F1 размножаться при температуре 20 градусов в течение двух-трех дней, пока не появится потомство. Как только поколение F 2 готово, они также наблюдаются за трансгенными животными. F Два животных, которые унаследовали и экспрессировали трансгенный маркер, считаются стабильной линией.

Каждая независимая стабильная линия должна поддерживаться как отдельная линия червей, размножающихся каждой линией, перенося несколько трансгенных животных на новую пластину в каждом поколении. Это необходимо выполнить с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Если выбираемый маркер является флуоресцентным для контроля вариабельности числа копий гена, сгенерируйте как минимум три независимые стабильные линии на каждую вводимую конструкцию.

Мы только что показали вам, как микроинжектировать экспрессию, векторные конструкции, а также увидеть элган и выбрать стабильные линии. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.