MODS метод диагностики туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и туберкулеза

На каждых трех человек в мире один инфицирован туберкулезом. Диагностика активного туберкулеза предотвращает появление новых инфекций, потому что пациенты с активным туберкулезом продолжают заражать от 10 до 15 других людей в год до тех пор, пока они не будут либо вылечены, либо умрут. Mods — это аббревиатура, которую мы используем, чтобы избежать необходимости говорить «микроскопическое наблюдение», «анализ чувствительности к лекарствам», и причина, по которой это называется, станет очевидной по мере объяснения методологии.

В коротком видео мы расскажем о методологии mods для быстрой и недорогой диагностики туберкулеза и туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью. В видео будет изложена методология шаг за шагом. Мы обсудим последствия работы с жидкими культурами для биобезопасности, а также объясним некоторые важные вопросы обеспечения качества, которые необходимы для использования этой методологии.

Анализ модов был разработан в Университете Каяна в Лиме, Перу, в лаборатории Боба Гилмана. После наблюдений, первоначально сделанных по рыхлому кави. LOOSE пытался определить быстрые способы выявления микобактерий туберкулеза в культурах с использованием колорметрических индикаторов.

Но она отметила, что наблюдение за этими культурами под микроскопом выявило наличие роста микробактерий за несколько дней до того, как колорметрические показатели изменили цвет, и именно на основе этого наблюдения был разработан анализ Министерства обороны. Анализ MOD был разработан в условиях ограниченных ресурсов и нацелен на ограниченные ресурсы, поэтому для выявления туберкулеза и множественной лекарственной устойчивости на основе жидких культур на тест приходится чуть менее 3. Это чрезвычайно привлекательно и впервые предоставляет такие диагностические возможности в местах с ограниченными ресурсами.

Таким образом, анализ модов основан на трех основных принципах. Первая заключается в том, что микобактерии туберкулеза растут в жидких средах гораздо быстрее, чем в твердых. Это факт, который известен уже много лет.

Во-вторых, если мы будем наблюдать за этими жидкими средами под микроскопом, мы сможем обнаружить рост myb tuberculosis гораздо быстрее, чем ожидание макроскопического появления колоний на твердых средах. И действительно, этот рост полностью характерен, так что мы можем отличить M. tuberculosis в жидких средах от бактерий или грибкового заражения, или даже от роста нетипичных нетуберкулезных микобактерий, которые могут присутствовать. Наконец, и это, пожалуй, самая захватывающая вещь в анализе модов, это то, что мы можем включать в состав препарат рифампицин и, следовательно, множественную лекарственную устойчивость непосредственно из мокроты.

Используя эти препараты в самом начале анализа, мы можем обнаружить как туберкулез, так и в то же время определить, устойчив ли изолят к этим двум препаратам. А это избавляет от необходимости субкультивировать и создавать непрямой тест на чувствительность к лекарствам. Итак, теперь мы просто расскажем об оборудовании, которое требуется для проведения анализа модов.

Холодильник нужен для того, чтобы хранить подготовленные носители. Весы необходимы для взвешивания ис и рифампицина. Вихрь нужен для перемешивания мокроты.

В случае раствора для обеззараживания требуется центрифуга для концентрирования обеззараженного образца мокроты, которая должна быть способна достигать 3000 G. Центрифуга не нуждается в охлаждении, но абсолютно необходимо, чтобы она была биобезопасной и была биобезопасной. Для работы с микобактериями необходимо, чтобы ведра центрифуги были закрыты запирающимися крышками. Требуется инкубатор, который может достигать 37 градусов и поддерживать 37 градусов по Цельсию.

Это не обязательно должно быть обогащено CO2. Для считывания мод планшетов требуется инвертированный микроскоп, и он должен иметь объективы четыре х и 10 х и автоклав нужен для стерилизации сред, а также для утилизации микробактериальной культуры, отходы микроорганизмов требуются для аликвот в средах, шкаф биологической безопасности. Второй класс необходим для процедур, связанных с манипуляциями с образцами мокроты и посевом пластин.

Реагенты, необходимые для выполнения мод-анализа, следующие: Миддлбрук семь Н девять медиа касционон и глицерин Панта, который является добавкой антибиотика и OADC. Запасами пищевых добавок антибиотиков являются рифампина диметилсульфоксид, ДМСО для приготовления рифампицина, гидроксид натрия, цитрат натрия и нилцистеин для обеззараживания мокроты, фосфат натрия и монокалийфосфат для приготовления фосфатного буфера, 10% гипохлорит натрия для утилизации инфицированных отходов и дезинфицирующее средство для очистки рабочих поверхностей. Также требуются следующие пластмассы и расходные материалы: стерильные стеклянные пробирки, фильтры 0,2 микрометра для водных растворителей и фильтры 0,2 микрометра для органических растворителей, микроцентрифужные пробирки, центрифужные пробирки 15 мил, стерильные 50 миллилитров, 10 миллилитровые серологические пробирки peppes, стерильные наконечники для микропипеток, 24 луночные планшеты для культуры тканей типа и герметичные пакеты типа Ziploc, которые 24 луночные планшеты помещаются после того, как образец мокроты инокулирован в среду.

Существует четыре группы стоковых растворов, которые можно приготовить заранее. Фосфатный буферный раствор состоит из комбинации одноосновных растворов фосфата натрия, диба и фосфата калия, отрегулированной до pH 6,8 плюс-минус 0,2. Этот раствор автоклавируется при температуре от 121 до 124 градусов по Цельсию в течение 15 минут для стерилизации, а аликвота культивируется на питательном агаре для подтверждения стерильности.

Его можно хранить в холодильнике при температуре от двух до восьми градусов по Цельсию до одного месяца. На каждый образец мокроты требуется 10 миллилитров фосфатного буферного раствора. Стоковый раствор для обеззараживания мокроты представляет собой комбинацию гидроксида натрия и цитрата натрия.

Эти растворы объединяют в равных объемах и автоклавируют при температуре от 121 до 124 градусов по Цельсию в течение 15 минут, а также могут храниться в холодильнике при температуре от двух до восьми градусов по Цельсию до одного месяца. На каждый образец мокроты требуется два миллилитра этого раствора. Основная питательная среда состоит из Миддлбрука seven H 9 с касционом и глицерином.

Порошок семи Н9 растворяют в стерильной дистиллированной воде, содержащей глицерин и касцион, и перемешивают при постоянном перемешивании до полного растворения. Этот фильтрующий материал автоклавируется при температуре от 121 до 124 градусов по Цельсию в течение 15 минут, а после охлаждения разделяется на 4,5 миллилитровые квадраты в стерильных стеклянных трубках размером 16 на 100 миллиметров. Среду инкубируют при температуре 37 градусов в течение 48 часов для проверки стерильности, которая проявляется в отсутствии мутности после этого времени и может храниться при температуре от двух до восьми градусов по Цельсию с плотно закрытой крышкой до одного месяца.

На каждый образец мокроты требуется одна пробирка, содержащая 4,5 миллилитра этой культуры. Средние стоковые растворы антибиотиков готовятся следующим образом: их полностью растворяют в стерильной дистиллированной воде и фильтруют с помощью шприца-фильтра 0,2 мкм для водных растворителей. Затем 20 микролитров аликвот можно хранить в стерильных микроцентрифугирующих пробирках при температуре минус 20 градусов по Цельсию до шести месяцев.

Стоковые растворы рифампицина в количестве восьми миллиграммов на милль получают путем растворения рифампицина в ДМСО и стерильной дистиллированной воде. Эта смесь фильтруется шприцем 0,2 мкм фильтром для органических растворителей и раствор может храниться в 20 микролитровых аликвотах в стерильных микроцентрифужных пробирках при температуре минус 20 градусов по Цельсию до шести месяцев, каждой 20 микролитров аликвоты достаточно до 100 образцов. Итак, теперь мы подошли к части самой методики и трем шагам, которые нужно сделать в день процедуры.

Это преобразование исходных решений в рабочие. Сначала у нас есть решение для обеззараживания, затем у нас есть решение для фильтрующего материала. И, наконец, рабочие растворы препаратов isen и Rifampin.

Метод обеззараживания, который используется для методологии mods, представляет собой стандартизированную методологию обеззараживания гидроксидом натрия nalk. Налк является муколитиком, который помогает переваривать мокроту и позволяет гидроксиду натрия проводить обеззараживание. Для этого нам понадобится наш стоковый раствор гидроксида натрия цитрата натрия, и 0,1 грамма NA добавляется к 20 мл этого раствора.

Любой раствор, который не был использован в день приготовления, должен быть выброшен. Окончательная подготовка питательной среды также должна производиться только в день использования. Хранящиеся семь Н девять сред совмещаются с ОАДК и панта, 4,5 миллилитров среды объединяются с 0,5 миллилитрами ОАДХ и 0,1 миллилитров Панта в каждой пробирке.

Этого достаточно для одного образца. Рабочие растворы каждого препарата готовятся в день применения, а любые неиспользованные растворы следует выбросить, поскольку активность не может быть гарантирована, хранящиеся аликвоты разводятся в 24 раза. Хорошо культивируют ткани последовательно со средами семь H девять oh A DC таким образом, что конечная концентрация в лунке, достигаемая после добавления образца мокроты со средой, составляет 0,4 микрограмма на тысячу фориновой кислоты и один микрограмм на милл для рифампицина.

Теперь перейдем к процедуре обеззараживания, два мила образца мокроты помещаются в коническую пробирку Falcon, а затем добавляются два мила нашего раствора для обеззараживания молока на основе гидроксида натрия. Крышка заменяется и плотно завинчивается, после чего суспензию закручивают и оставляют стоять на 15 минут, в течение которых происходит процедура обеззараживания. По истечении этого времени добавляется 14 миллилитров фосфатного буферного раствора.

Крышка закручивается и плотно завинчивается, и пробирка помещается в центрифугу через 50 минут при температуре 3000 G, надосадочная жидкость S сцеживается, и оставшаяся гранула представляет собой образец, который мы хотим выложить с помощью 5,1-миллилитровых пробирок семи пантеров H nine OEDC. Наша пеллета ресуспендирована до объема примерно два миллилитра. Половина этого ресуспендированного образца хранится в качестве резервной копии в микроцентрифужной пробирке.

Это доступно на случай, если наша культура будет загрязнена и нам нужно будет снова выгрузить образец. Другой миллилитр добавляется к оставшимся семи H 9 oh a DC panter, который находится в нашей стеклянной трубке, и это наш образец, который готов к выгрузке. По 900 микролитров этой суспензии среды и образца помещают в каждую из четырех лунок в колонне из 24-луночного планшета.

Оставшиеся лунки 24-луночной пластины заполняются последующими пробами таким образом, что пять проб заполняют 24-луночную пластину, по одной на каждую из пяти колонн, а шестая колонна остается без пробы. Шестой столбец служит отрицательным контролем в этом столбце. Он помещает все составляющие среды без образца мокроты, и очевидно, что любой рост в этой колонке указывает на то, что у нас есть проблема с перекрестным загрязнением, и вся пластина должна быть выброшена.

Каждая пластина, которую мы запускаем, требует столбца отрицательного контроля. Итак, теперь у нас есть тарелка, содержащая все наши образцы и носители. Мы должны добавить наши суспензии антибиотиков в отдельную тарелку.

Мы приготовили наши разведения, как описано ранее для Рифампицина и Изида, и с помощью четырехканального мультипэта мы собираем по 100 микролитров из каждой из этих лунок и распределяем по 100 микролитров семи H 9 OADC в каждую из двух контрольных лунок и по 100 микролитров рифампицина и 100 микролитров изида в каждую из двух лунок, содержащих лекарственные препараты. Как только тарелка готова, крышку закладывают на место и помещают внутрь. Пакет с застежкой-молнией с этого момента пакет больше не открывается, а потому любые культуры, которые растут в жидких средах, никогда не имеют возможности покинуть пакет.

С этого момента все показания планшета выполняются внутри пакета, а пакет помещается в автоклавный пакет и отбрасывается в конце культивирования. И таким образом мы избегаем манипуляций с высококонцентрированными суспензиями микобактерий. Сейчас мы лишь скажем несколько слов о контроле качества.

В методологию модов встроены средства контроля качества, которые необходимы для правильного использования анализа. Прежде всего, есть отрицательные элементы управления, и они работают на каждой пластине. Они уже упоминались ранее, но вкратце, у нас есть колонка, которая содержит все составляющие среды без присутствия образца мокроты вместе с пятью другими образцами мокроты на планшете, лунки в колонке должны быть исследованы так же, как и любые другие лунки, и наличие любого роста в этих лунках указывает на то, что произошло перекрестное загрязнение, и поэтому ни одному из результатов на планшете нельзя доверять.

Поэтому пластина должна быть отброшена, а все образцы должны быть повторно покрыты. Кроме того, существуют средства внутреннего контроля, которые являются положительными средствами контроля. Они наносятся на отдельную пластину, и эта пластина подготавливается после того, как все остальные образцы планшетов будут подготовлены в конце дня, чтобы свести к минимуму риск перекрестного загрязнения в лаборатории.

На этой отдельной пластине мы поместили один полностью восприимчивый штамм микобактерии туберкулеза и штамм, устойчивый к изиду и рифампицину. Если есть опасения по поводу запуска штамма с множественной лекарственной устойчивостью на планшете, штамм рифампицин с монорезистентностью может быть запущен без монорезистентного штамма вместо этих двух чувствительных и MDR-штаммов. Цель этих штаммов состоит в том, чтобы продемонстрировать не только то, что среда поддерживает рост, поэтому все наши положительные контрольные группы должны иметь рост в безнаркотическом богатстве, но также и то, что наши концентрации лекарств правильны, и поэтому восприимчивые положительные контрольные группы не должны расти в присутствии ис и рифампицина, а резистентные положительные контрольные линзы должны очевидно расти за счет концентраций рифампина и иша, которые присутствуют в пластине.

Итак, теперь перейдем к чтению на тарелках. Если мы рассматриваем день снятия покрытия из наших образцов, то нулевой день снятия показаний начинается на пятый день. До этого рост микобактерий наблюдался очень редко.

Пластины исследуются под микроскопом с инвертированным светом. Это означает, что пластины исследуются снизу вверх, и это позволяет нам очень четко видеть шнуры, попытка визуализировать культуры сверху затруднена конденсацией на крышке пластин, а также тем, что фокусное расстояние не соответствует стандартному микроскопу. Микроскопическое исследование, как правило, проводится с 10 объективно положительными культурами, рассматриваемыми как одна, в которой присутствуют, по крайней мере, две колониеобразующие единицы в обеих лунках, свободных от наркотиков.

Наличие загрязнения легко распознать, потому что среда становится мутной, и к пятому дню обычно происходит зарастание большей части колодца. Напротив, рост микобактерий не приводит к помутнению хорошо начального роста микобактерий в виде небольших запятообразных форм, которые неуклонно прогрессируют, образуя характерные хорды или клубки. В течение двух недель сильный положительный рост образует конгломераты микобактерий со шнурами, действительно видимыми только на конечностях.

Подавляющее большинство культур, которые должны стать положительными, являются положительными к 14-му дню, и поэтому мы рекомендуем проводить ежедневные считывания с пятого по 14-й день, а затем считывать показания каждые два или три дня в зависимости от лабораторной нагрузки. Любой рост в присутствии любого из препаратов указывает на устойчивость к этому препарату. Очень важно отметить, что если область лунок, содержащих наркотики, проводится более чем через неделю после того, как в лунках, свободных от наркотиков, будет отмечен положительный посев, это может не свидетельствовать об устойчивости, поскольку время от времени наблюдается прорывной рост.

Показания могут быть прекращены на 21-й день, если посев отрицательный, так как положительные результаты бактериологического исследования после этого времени никогда не встречаются у пациентов, не получающих терапию. Культуры остаются в пакетах с застежкой-молнией и помещаются в автоклавные пакеты и автоклавы при температуре от 121 до 124 градусов по Цельсию в течение 45-60 минут, после чего их можно безопасно выбросить. Я просто скажу несколько слов о биобезопасности и анализе модов, поскольку мы внедряем моды не только в Перу, но и в Африке и Азии.

Периодически возникает вопрос о безопасности и биобезопасности использования микробактериальных культур в жидких средах. Это вполне объяснимый страх, потому что очевидно, что жидкости могут быть разлиты, а твердые среды не несут такого риска, а также существует риск аэрозолизации, когда мы имеем дело со взвесями микобактерий. Именно по этим причинам мы считаем, что методология модификации является более безопасной методологией, чем любая методология, требующая косвенного тестирования чувствительности к наркотикам.

Причина этого заключается в том, что для тестирования на непрямую восприимчивость готовят суспензию известной концентрации микробактерий. Таким образом, это включает в себя манипуляции с высококонцентрированными растворами микробактерий со всеми сопутствующими рисками разлива и аэрозолизации. В отличие от этого, методология mods, как вы уже могли видеть, просто включает в себя инокуляцию образца мокроты в нашу пластину, после чего пластина запечатывается в пластиковый пакет.

Этот мешок больше никогда не открывается, и поэтому нам не приходится иметь дело с этими высококонцентрированными взвесями. Это не значит, что мы считаем методологию модификации абсолютно безопасной: обращение с микобактериями всегда несет риск. Тем не менее, данные из Кореи, опубликованные в 2006 году, казалось, подтвердили нашу позицию, что моды не более опасны, чем вытеснение любой другой культуры.

Это было исследование, проведенное среди лабораторных работников, которое показало, что профессиональные риски для лабораторных работников, которые проводили бактериологическое исследование и не несли ответственности за определение чувствительности к наркотикам, были не выше, чем у тех, кто проводил микроскопию мазка мокроты. Напротив, те, кто работает со суспензиями микобактерий и проводит тестирование на чувствительность к лекарствам, имеют гораздо более высокие показатели профессионального риска развития туберкулеза. Очевидно, что крайне важно, чтобы весь персонал трудовых лабораторий был защищен настолько, насколько это возможно, и поэтому мы настоятельно рекомендуем не проводить ни одну из этих процедур без надлежащей индивидуальной защиты органов дыхания, под которыми мы подразумеваем стандартные маски N95.

Кроме того, требуется шкаф или колпак биологической безопасности второго класса, в котором все выработанные помещения фильтруются через фильтры HEPA. Наконец, простой механизм, который очень важен для предотвращения турбулентности воздушного потока в лаборатории, — это замок на двери лаборатории, который предотвращает вход и выход персонала во время обработки образцов. Это снижает риск передачи инфекции в лаборатории, поэтому я надеюсь, что у вас есть хороший обзор того, что включает в себя методология модов и насколько она может быть полезна в условиях, где ресурсы ограничены, но срочно требуется высококачественная диагностика туберкулеза и туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью.

Для получения дополнительной информации вы можете посетить наш веб-сайт mods peru.org, где вы найдете наши подробные стандартные операционные процедуры, руководство пользователя по модам. В дополнение к СОП по обработке внелегочных проб, у нас также есть фототека микобактерий и туберкулеза, других микобактерий и бактериального и грибкового загрязнения, а также вы можете ознакомиться с нашей стратегией обеспечения качества и процедурой, которую мы рекомендуем для аккредитации лабораторий, чтобы начать использовать моды.

Наконец, есть лист часто задаваемых вопросов, и мы будем рады любым отзывам от пользователей, которые в настоящее время используют моды, поскольку это итеративная методология. Как мы объясняли ранее, это непатентованный тест, и мы всегда заинтересованы в улучшениях, которые удалось сделать другим лабораториям.