Протоколы для устного Заражение чешуекрылых Личинки с Baculovirus

В этом видео, мы демонстрируем пероральных способов заражения личинками чешуекрылых с бакуловирус, чтобы определить, инсектицидных эффективности.

Вирус Вао обычно используется в качестве вектора ДНК, используемого в сочетании с клеточными линиями насекомых для экспрессии белков. Тем не менее, тот факт, что этот вирус эффективно заражает насекомых с летальными последствиями, также делает его эффективным инсектицидным средством. В Бразилии, например, вирус бало дикого типа ежегодно применяется на более чем 1 миллионе гектаров посевов сои для борьбы с гусеницей бархатных бобов с целью повышения их инсектицидной эффективности.

В этом видео мы демонстрируем методы перорального заражения личинок чешуекрылых вирусом бакао с целью анализа инсектицидной эффективности. Здравствуйте, я из лаборатории слепой кости на факультете офтальмологии и в Университете штата Айова, и я Венди Спаркс, также работающая в лаборатории по обвалке. Сегодня мы покажем вам две процедуры заражения вирусом VA lter и личинок.

Сначала Харран покажет вам, как заразить личинок новорожденных с помощью биопробы, основанной на капельном питании. А затем я покажу вам, как заразить личинок среднего и позднего возраста с помощью биоанализа крови на диете. Итак, приступим.

Биотесты с капельным питанием могут быть использованы для определения летальной дозы абакавира и выживаемости. Время заражения вирусом бало личинок. Для этого анализа обычно используются личинки ранних стадий или новорожденные.

Прежде чем начать, убедитесь, что у вас под рукой есть диетические чашки с подходящей диетой. Также готовят соответствующие вирусные разведения, включают зеленый пищевой краситель в концентрации 4% по объему. Для того чтобы определить смертельную концентрацию вируса, разведение должно дать диапазон смертности от одного до 99%. Могут потребоваться предварительные биоанализы для определения соответствующего диапазона концентраций вируса после вортексирования пробирки, чтобы предотвратить оседание многогранников, сделайте два концентрических круга из мелких капель раствора вируса в чашке Петри диаметром 60 миллиметров.

Для каждой используемой концентрации вируса не забудьте также настроить имитацию заражения с отрицательным контролем. Далее после обработки перенесите от 25 до 30 личинок новорожденных в середину концентрических кругов с помощью стерильной кисти. Накройте блюдо крышкой и закройте параформом, чтобы предотвратить побег личинок.

В идеале используйте разные кисти для передачи вируса каждому типу вируса, чтобы предотвратить заражение между обработками. Дайте блюду постоять при комнатной температуре от 10 до 15 минут, за это время выпьйте личинки. Раствор личинок, которые питались, можно определить по зеленой окраске передней кишки, полученной в результате того, что зеленый пищевой краситель переносит только те личинки, которые питались одной унцией пластиковых стаканчиков, которые содержат диетический перенос одной личинки на чашку.

После переноса личинок накройте стаканчики крышками и инкубируйте при температуре 28 градусов Цельсия через 24 часа после заражения. Удалите все стаканчики, содержащие мертвых личинок. Эти ранние смерти, вероятно, являются результатом травм при обращении.

При использовании этого биотеста для определения смертельной дозы личинки следует проверять каждые два-три дня до тех пор, пока фиктивные инфицированные личинки и любые выжившие личинки, обработанные вирусом, не очистятся или не начнут заимствовать для окукливания. Мертвые личинки иногда превращаются в черных личинок, которые умирают от инфекции, по сути, превращаются в мешки из многогранников, которые полностью растворяются. Если в это время возникли механические нарушения, оценивайте смертность личинок при каждой обработке.

Биотесты на летальную концентрацию должны быть повторены три или четыре раза в отдельных случаях. Используйте 30 особей на одну дозу для каждого вируса или контрольного лечения. Используйте соответствующую программу анализа наследства, такую как polo или SAS, для расчета значений lc 50, 95% доверительных интервалов и соответствующей статистики.

Этот анализ питания каплями также может быть использован для определения значений времени выживания ST 50. В этом случае смертность личинок оценивается каждые четыре-восемь часов с более частыми наблюдениями. Если уровень смертности высок, время выживаемости высокое, биотесты проводят с использованием lc 99 дозы медианы выживаемости вируса, а 95% доверительные пределы рассчитываются с помощью оценки Каплана Майера с использованием программы s плюс или SAS.

Теперь, когда Харанг показал вам биотест на воздушно-капельное питание, я покажу вам биотест на диетическую пробку. Личинки среднего и позднего возраста питаются диетической пробкой, обработанной известной дозой вируса, для определения смертельной дозы или LD 50 за день до проведения этого анализа. Уберите рацион из чашки, чтобы заморить личинок голодом на ночь.

Этот шаг позволит увеличить скорость, с которой личинки потребляют вирус. Привили диетический кубик на следующий день, приготовьте рацион, нарезав его небольшими кубиками около двух кубических миллиметров. Если кубики в рационе будут слишком мелкими, они высохнут.

Если кубики рациона слишком большие, личинки не смогут съесть весь кубик рациона за ночь. Теперь добавьте от одного до двух микролитров суспензии многогранников в каждый диетический кубик. Суспензия содержит 4% по объему пищевого красителя.

Дайте суспензии впитаться в рацион на пять-15 минут. Не забудьте также приготовить фиктивный вирус, обработанный диетическим кубом в качестве негативного контроля. Далее переложите по одному кубику диеты на каждую личинку четвертого возраста в каждой чашке.

Затем поместите стаканчики в инкубатор на ночь при температуре 28 градусов Цельсия на следующий день, отбросьте все личинки, которые не полностью съели диетический кубик. Затем добавьте в каждую чашку большой кусок рациона для оставшихся личинок. Поддерживайте личинок при температуре 28 градусов по Цельсию, добавляя дополнительную диету по мере необходимости, пока фиктивные инфицированные личинки и выжившие личинки, инфицированные вирусом, не окукливаются или не начнут окукливаться.

В это время записывают количество погибших и выживших насекомых. Мы просто покажем вам два метода заражения насекомых вирусом спины: кровотечение, биопсия кормления и биопсия диетического бляшки. При выполнении этой процедуры важно помнить, что трупы убитых вирусом личинок, как правило, хрупкие и могут легко разорвать высвобождающий вирус.

Поэтому стерилизуйте рабочие поверхности и утилизируйте загрязненные перчатки и одноразовые материалы соответствующим образом, чтобы предотвратить загрязнение. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.