Протоколы для Microapplicator при содействии Заражение чешуекрылых Личинки с Baculovirus

В то время как специфический для членистоногих вирус baccala используется в качестве стандартного исследовательского инструмента для систем экспрессии эукариотических белков, он также разрабатывается как экологически безопасное инсектицидное средство, которое может убивать травоядных насекомых, таких как чешуекрылые в природе. Личинки чешуекрылых заражаются вирусами баккалы при поедании зараженной листвы. Личинки или гусеницы поглощают вирус baccala в форме, известной как многогранник, который представляет собой комплекс вирусных частиц, упакованных в крупную кристаллическую белковую структуру, защищающую вирус от высыхания.

Как только личинка инфицирована, батальный вирус распространяет инфекцию внутри насекомого. Вирус захватывает механизм синтеза нуклеиновых кислот и белков хозяина, чтобы произвести больше вируса и многогранников. В конце концов личинки настолько сильно заражаются вирусом, что растворяются в беспорядочной жиже многогранников, которая капает на поверхности растений, съеденных насекомым, а затем цикл начинается заново, чтобы определить инсектицидную эффективность конкретного бака.

Методы микроаппликатора штамма Avir и биотесты можно комбинировать. Личинки Leid dorin могут быть инфицированы путем инъекции баттерного вируса непосредственно в HemosIL или полость тела, и можно оценить уровень смертности. Кроме того, личинки могут быть инфицированы многогранниками с помощью перорального микроаппликатора, а также могут быть проанализированы сроки инфицирования кишечника и других тканей.

Привет, я Венди Спаркс в лаборатории Брайана и обвалки на факультете энтомологии в Университете штата Айова. И я также из Boning Snap. Сегодня мы покажем вам две процедуры заражения лабораторного протока DI вирусом бэклога. В обоих методах используется микроаппликатор.

Во-первых, я покажу вам, как использовать микроаппликатор для доставки вируса в организм через него. Затем, когда вы покажете, вы используете микроаппликатор для подачи полиэтиленового разъема в среднюю защиту через мышь. Итак, приступим.

При разработке в инсектицидных целях вирусы бало обычно содержат ген многогранника, способствующий заражению личинок вредителя полостью рта. Тем не менее, иногда есть причины проверить полиэдроотрицательный вирус баккалы на потенциальные инсектицидные эффекты или обойти кишечник насекомого. В этом случае может быть выполнена инъекция батального вируса с помощью микроаппликатора для заражения личинок до начала анализа.

Титр рабочего состава батированного вируса следует определять с помощью анализа бляшек или конечных анализов разведения. Для физиологических экспериментов типичными являются инъекции в пять раз по 10 до четвертой БОЕ на одну пятую инстарию H VNS. Чтобы начать этот биоанализ, загрузите каждый разведение вируса в пластиковый шприц объемом один куб. см к геркулесу с острым кончиком иглы 28,5 или 32 калибра.

Обычно от одного до трех микролитров встык раствора вируса. При титре от 10 до седьмой, минус 10 к восьмой на миллилитр можно использовать для каждой личинки так, что загрузки от 300 до 500 микролитров в шприц достаточно для большинства целей. Затем выгоните пузырьки воздуха из шприца, удерживая шприц вертикально, чтобы воздух подал к кончику иглы и вывел его.

Затем закрепите шприц на опорной трубке шприца. Теперь установите объем на 1,0 микролитра. Для каждой капли на микропроцессорном блоке управления микроаппликатора сначала откалибруйте блок управления, чтобы убедиться в правильном объеме, скорость подачи капли может быть установлена по шкале от нуля до девяти.

Обычно используется диапазон от нуля до единицы. Нажмите на ножной переключатель, чтобы убедиться, что раствор дозирован правильно. Помните, что если выдается слишком много раствора или если внесение происходит слишком медленно, настройки объема и скорости можно регулировать до тех пор, пока не будет нанесен нужный объем раствора с правильной скоростью.

Теперь я готов начать инъекцию от инфекции H VNS. На ранних пятых стадиях обычно инъецируются личинки, больший размер более поздних возрастов облегчает процесс инъекции. Введите кончик иглы через планку одной из прод-ног и в полость тела.

Обратите внимание, когда кончик иглы вводится в прол, измените положение тела личинки Чтобы не повредить кишечник и стенки тела, теперь нажмите ножной переключатель четыре раза, чтобы доставить четыре микролитра раствора вируса в гемоуплотнение. После того, как уколы будут завершены, верните всех личинок в инкубатор с температурой 28 градусов Цельсия. Часто проверяйте наличие мертвых личинок и убедитесь, что для выживших личинок доступна адекватная диета.

Несмотря на то, что поздние возрасты не умирают от повреждения кутикулы в результате инъекции, личинки все равно должны быть проверены через 24 часа после инъекции на предмет повреждения кишечника, которое может быть вызвано бактериальной инфекцией. Эта ранняя смертность должна быть исключена из анализа данных. При использовании биопроб с помощью микроаппликатора с баттированным вирусом для биопроб с летальной концентрацией, биопроба должна быть повторена три или четыре раза в отдельных случаях.

Используйте 30 особей на одну дозу для каждого вируса или контрольного лечения. Используйте соответствующую программу анализа наследства, такую как polo или SAS, для расчета значений lc 50, 95% доверительных интервалов и соответствующей статистики. Этот биоанализ также может быть использован для определения значений времени выживания ST 50 после инокуляции фиксированной дозы вируса.

В этом случае смертность личинок оценивается каждые четыре-восемь часов с более частыми наблюдениями. Если уровень смертности высок, медиана выживаемости в 95% доверительных пределах рассчитывается с помощью оценки Каплана Мейера с использованием программы s плюс или SAS. Теперь, когда Харран показал вам биотест с помощью микроаппликатора с использованием баттированного вируса.

Я покажу вам анализ. Использование многогранников Пероральная инокуляция многогранников непосредственно в кишечник насекомого используется, когда точное время заражения имеет решающее значение. Например, при наблюдении за тем, как вирус распространяется внутри насекомого, для начала этого анализа суспендируют многогранники в нейтрально плавучем растворе глицерина в три к двум и воде от 10 до 300.

Многогранники могут быть использованы, например, для четвертого возраста. Затем загрузите этот раствор в пластиковый или стеклянный один туберкулиновый шприц CC с тупым наконечником иглы 32 калибра. Установите шприц на опорную трубку микроаппликатора, глядя в микроскоп.

Держите четвертую или пятую в звездчатой личинке, введите иглу через рот в переднюю область средней кишки, затем введите многогранники. Эта техника требует некоторой практики. Во-первых, может быть сложно удерживать личинок в перчатках, не раздавливая их.

Во-вторых, требуется некоторая практика, чтобы провести иглой мимо ротовых частей. Мы рекомендуем вам попрактиковаться в прививке PBS около 30 личинок. Если вам все-таки случится проколоть кишечник, это будет очевидно, ведь личинки меланы и довольно быстро почернели.

Опять же, поскольку пероральная инокуляция с помощью микроаппликатора обеспечивает точное время заражения, этот метод наиболее полезен для экспериментов, в которых время заражения важно для определения того, как вирус распространяется внутри насекомого. Например, вирусы, экспрессирующие бета-галактозы, могут быть перорально инокулированы в личинки, которые затем препарируются в различные моменты времени, чтобы определить, какие ткани заражаются. Любовь насекомых с вирусом, первым из которых была прямая инокуляция через pro Legg от вируса, и это позволяет обойти физиологию кишечника и оценить летальность и летальное время вируса, который вас интересует.

Второй метод представлял собой прямую инокуляцию в среднюю кишку с использованием многогранников. Это позволяет доставлять очень точную дозу непосредственно в среднюю кишку, а также контролировать очень точное время события. Затем вы можете изучить смертность и другие фенотипы вируса.

При выполнении этой процедуры важно помнить, что трупы убитых вирусом личинок, как правило, хрупкие и могут легко разорвать высвобождающий вирус. Поэтому стерилизуйте рабочие поверхности и утилизируйте загрязненные перчатки и одноразовые материалы соответствующим образом, чтобы предотвратить загрязнение. Вот и все.

Спасибо за просмотр. Удачи в вашем эксперименте.