Протоколы для Microapplicator при содействии Заражение чешуекрылых Личинки с Baculovirus

В то время как специфичный для членистоногих бакуловирус используется в качестве стандартного исследовательского инструмента для систем экспрессии эукариотических белков, он также разрабатывается как экологически безопасный инсектицидный агент, способный уничтожать насекомых-фитофагов, таких как чешуекрылые, в естественной среде. Личинки чешуекрылых заражаются бакуловирусами при поедании зараженной листвы. Личинки или гусеницы заглатывают бакуловирус в форме, известной как полиэдрическое включение, которое представляет собой комплекс вирусных частиц, упакованных в крупную кристаллическую белковую структуру, защищающую вирус от высыхания.

После заражения личинки вирус распространяет инфекцию внутри насекомого. Вирус перехватывает механизмы синтеза нуклеиновых кислот и белков хозяина для производства новых вирусных частиц и полиэдров. В конечном итоге личинки заражаются вирусом настолько глубоко, что превращаются в вязкую массу из полиэдров, которая стекает на поверхности растений, поедаемых насекомыми; затем цикл повторяется, чтобы определить инсектицидную эффективность конкретного Baca.

Методы использования микроаппликатора для штаммов вируса и биоанализы могут быть объединены. Личинок Leid dorin можно заражать путем введения вируса непосредственно в HemosIL или полость тела с последующей оценкой показателей смертности. Кроме того, личинок можно заражать полиэдрами с помощью инъекции при поддержке орального микроаппликатора, что позволяет анализировать время инфицирования кишечника и других тканей.

Здравствуйте, я Венди Спаркс из лаборатории Брайана Бонинга на кафедре энтомологии Университета штата Айова, а также из компании Boning Snap. Сегодня мы продемонстрируем вам две процедуры инфицирования лабораторных уток DI вирусом BKV. В обоих методах используется микроаппликатор.

Сначала я покажу вам, как использовать микроаппликатор для введения вируса в гениталии через проле. Затем я продемонстрирую использование микроаппликатора для введения поли-хедера в средний отдел кишечника через рот. Итак, приступим.

При разработке вирусов в инсектицидных целях в состав бакуловирусов обычно включают ген полиэдра для облегчения перорального заражения личинок вредителей. Однако иногда возникают причины для тестирования бакуловирусов, не содержащих ген полиэдра, на предмет потенциального инсектицидного воздействия или для обхода кишечника насекомого. В таком случае для заражения личинок перед началом анализа может быть выполнено введение вируса с помощью микроаппликатора.

Титр рабочего стока инактивированного вируса следует определить с помощью метода анализа бляшек или метода серийных разведений до достижения конечной точки. Для физиологических экспериментов типичной будет доза в 5 × 10⁴ PFU на одну особь H VNS пятой линьки. Для начала данного биоанализа внесите каждое разведение инактивированного вируса в пластиковый шприц объемом 1 cc с острой иглой калибра 28.5 или 32G.

Обычно для каждой личинки используют от одного до трех микролитров раствора вируса с титром от 10⁷ до 10⁸ на миллилитр, так что для большинства целей достаточно набрать в шприц от 300 до 500 микролитров. Затем удалите пузырьки воздуха из шприца, удерживая его вертикально, чтобы воздух поднялся к кончику иглы, и выдавите его.

Затем закрепите шприц на опорной трубке для шприца. Теперь установите объем 1,0 µL. Для каждой капли с помощью блока микропроцессорного управления микроаппликатора сначала откалибруйте блок управления, чтобы обеспечить выдачу правильного объема; скорость выдачи капли можно настроить по шкале от нуля до девяти.

Обычно используется диапазон от нуля до единицы. Нажмите на ножную педаль, чтобы убедиться, что раствор подается надлежащим образом. Помните, что если подается слишком много раствора или подача происходит слишком медленно, настройки объема и скорости можно отрегулировать до тех пор, пока не будет достигнут правильный объем раствора при соответствующей скорости подачи.

Теперь я готов приступить к инъекции для заражения H VNS. Обычно инъекции проводят личинкам на ранней стадии пятого возраста, так как их больший размер по сравнению с более ранними стадиями облегчает процесс введения. Введите кончик иглы через подошву одной из грудных ног в полость тела.

Обратите внимание, что при введении кончика иглы в пролегу положение тела личинки может измениться. Чтобы избежать повреждения кишечника и стенки тела, нажмите на ножную педаль четыре раза, чтобы ввести четыре микролитра раствора вируса в гемолимфу. После завершения инъекций верните всех личинок в инкубатор при 28 °C. Регулярно проверяйте наличие погибших личинок и обеспечьте наличие достаточного количества корма для выживших особей.

Несмотря на то, что личинки поздних возрастов не погибают от повреждений кутикулы, вызванных инъекцией, их все равно следует проверить через 24 часа после процедуры на предмет повреждения кишечника, которое может возникнуть вследствие бактериальной инфекции. Такую раннюю смертность следует исключить из анализа данных. При использовании биоанализа с применением микроаппликатора и вируса в форме бутонов для определения летальной концентрации, биоанализ следует повторить три или четыре раза в разные дни.

Используйте по 30 особей на дозу для каждого вируса или контрольной группы. Используйте подходящую программу для проб-анализа, такую как polo или SAS, для расчета значений LC50, 95% доверительных интервалов и соответствующих статистических показателей. Данный биоанализ также может быть использован для определения значений ST50 (времени выживаемости) после инокуляции фиксированной дозы вируса.

В данном случае смертность личинок оценивают каждые четыре-восемь часов с проведением более частых наблюдений. Если уровень смертности высок, медианное время выживаемости с 95% доверительным интервалом рассчитывают с помощью метода Каплана-Мейера в программе S-PLUS или SAS. Теперь, когда Харран продемонстрировал вам биоанализ с использованием микроаппликатора для вируса Butted.

Я продемонстрирую вам данный анализ. Пероральное введение полиэдров непосредственно в кишечник насекомого используется в тех случаях, когда критически важно точно определить время инфицирования. Например, при мониторинге распространения вируса в организме насекомого. Для проведения этого анализа суспендируйте полиэдры в нейтральном растворе глицерина и воды в соотношении 3:2 в концентрации от 10 до 300.

Полиэдры можно использовать, например, для заражения личинок четвертой стадии. Затем наберите данный раствор в пластиковый или стеклянный туберкулинный шприц объемом 1 с тупой иглой 32-го калибра. Установите шприц на опорную трубку микроаппликатора, глядя в микроскоп.

Зафиксируйте личинку четвертой или пятой стадии в форме звезды, введите иглу через ротовое отверстие в переднюю часть средней кишки, затем введите полиэдры. Эта техника требует определенной сноровки. Во-первых, может быть сложно удерживать личинок в перчатках, не раздавив их.

Во-вторых, требуется определенная практика, чтобы провести иглу мимо ротовых органов. Мы рекомендуем потренироваться, инокулировав около 30 личинок раствором PBS. Если вы случайно проткнете кишечник, это станет очевидным, так как личинки подвергнутся меланизации и довольно быстро почернеют.

Поскольку пероральное заражение с помощью микроаппликатора позволяет точно определить время инфицирования, данный метод наиболее полезен для экспериментов, в которых время заражения имеет решающее значение для определения того, как вирус распространяется внутри насекомого. Например, вирусы, экспрессирующие бета-галактозидазу, могут быть введены перорально личинкам, которые затем препарируют в разные моменты времени, чтобы определить, какие ткани заражаются. Мы продемонстрируем вам два способа инфицирования насекомых с помощью микроаппликатора. Первый из них — это прямая инокуляция вируса через пронотальную пластинку, что позволяет обойти физиологию кишечника и оценить летальность и время гибели от интересующего вас вируса.

Вторым методом была прямая инокуляция в средний отдел кишечника с использованием полиэдров. Это позволяет ввести строго определенную дозу препарата непосредственно в средний отдел кишечника, а также точно контролировать время воздействия. Впоследствии можно изучить смертность и другие фенотипы вируса.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что личинки, погибшие от вируса baula, обычно хрупкие и могут легко разорваться, что приведет к высвобождению вируса. Поэтому стерилизуйте рабочие поверхности и утилизируйте загрязненные перчатки и одноразовые материалы соответствующим образом для предотвращения контаминации. На этом всё.

Спасибо за просмотр. Желаем успехов в вашем эксперименте.