Неспецифические Сигма активность протеаз Пробирной - казеин, как субстрата

Протеазы расщепляют пептидные связи в лабораторных условиях. Часто возникает необходимость измерить и/или сравнить активность протеаз. Универсальный анализ активности протеаз от Sigma может использоваться в качестве стандартизированной процедуры для определения активности протеаз, что мы и делаем в ходе процедур контроля качества.

В данном анализе казеин выступает в качестве субстрата, который расщепляется тестируемой протеазой. В результате высвобождается аминокислота тирозин, а также другие аминокислоты и пептидные фрагменты. Свободный тирозин затем вступает в реакцию с фольин-цилкейльским фенолом или реагентом Фолина, образуя хромофор синего цвета, количество которого можно определить путем измерения значения абсорбции на спектрофотометре.

Чем больше тирозина высвобождается из казеина, тем больше образуется хромофоров и тем выше активность протеазы. Значения абсорбции, полученные в результате активности протеазы, сравниваются со стандартной кривой, которая строится путем взаимодействия известных количеств тирозина с реагентом Фолина-Чокальто (FC) для корреляции изменений абсорбции. На основании количества тирозина в микромолях, определенного по стандартной кривой, можно рассчитать активность образцов протеазы в единицах, где единица представляет собой количество микромолей эквивалента тирозина, высвобождаемого из казеина в минуту. Здравствуйте, меня зовут Кэрри Кап Винард, я ученый в центре Sigma Aldrich DeKalb здесь, в Сент-Луисе, штат Миссури.

Сегодня я продемонстрирую вам универсальный способ определения протеазной активности в Sigma Aldridge. В основном мы используем этот анализ в отделе контроля качества, чтобы убедиться в достаточной активности протеазы перед ее прямой отправкой в вашу лабораторию. Перед началом анализа необходимо убедиться, что следующие реагенты подготовлены правильно.

50 миллимолярный калий-фосфатный буфер, pH 7.5. Перед использованием раствор помещают при температуре 37 °C; 0,65% (масса/объем) раствор казеина готовят путем смешивания 6,5 мг/мл в одном литре. Температуру раствора постепенно повышают при осторожном перемешивании до 80–85 °C примерно на 10 минут до достижения гомогенной дисперсии.

Очень важно не доводить раствор до кипения. Затем, при необходимости, значение pH корректируют с помощью гидроксида натрия и соляной кислоты. Раствор трихлоруксусной кислоты с концентрацией 110 мМ, приготовленный путем разбавления 6,1 Н стокового раствора очищенной водой в соотношении 1:55, 0,5 мМ реагента Фоллина-Цокаля или Фоллина-Фенола, который при взаимодействии с тирозином вызывает измеримое изменение цвета.

Это будет напрямую связано с активностью протеаз. 500 мМ раствор карбоната натрия, приготовленный из 53 мг/мл безводного карбоната натрия в очищенной воде, и раствор для разведения фермента, состоящий из 10 мМ натрий-ацетатного буфера с 5 мМ кальция, pH 7,5 при 37 °C. Этот раствор мы используем для растворения твердых образцов протеаз или разведения растворов ферментов.

Стандартный стоковый раствор L-тирозина, начальная концентрация которого должна составлять 1,1 мМ (раствор L-тирозина с концентрацией 0,2 мг/мл), готовят в очищенной воде, осторожно нагревая до полного растворения тирозина. Как и в случае с казеином, не доводите этот раствор до кипения. Дайте стандартному раствору L-тирозина остыть до комнатной температуры.

Этот раствор будет дополнительно разбавлен для построения стандартной кривой, если возникнет такая необходимость; используется твердый образец протеазы с заранее определенной активностью, который растворяют в разбавителе фермента до концентрации от 0,1 до 0,2 единиц на миллилитр. Этот раствор служит положительным контролем для анализа контроля качества и валидации расчетов, которые мы проведем для определения активности фермента. Теперь, когда реагенты подготовлены и доведены до нужной температуры, мы приступим к анализу протеазы.

Для начала данного анализа подберите подходящие пробирки объемом около 15 миллилитров. Для каждого тестируемого фермента потребуется четыре пробирки. Одна пробирка будет использоваться в качестве холостой пробы, а три другие — для определения активности трех образцов.

Разведение протеазы в трех вариантах полезно для взаимной проверки окончательных расчетов. В каждый набор из четырех пробирок добавьте по 5 mL 0,65% раствора казеина и выдержите их в водяной бане при температуре 37 °C примерно в течение пяти минут. Затем добавьте различные концентрации раствора фермента в три из пробирок с исследуемыми образцами, исключая холостую пробу. Перемешайте содержимое круговыми движениями и инкубируйте при 37 °C ровно 10 минут.

В течение этого времени инкубации будет измеряться протеазная активность и последующее высвобождение тирозина, которые затем будут сравниваться между исследуемыми образцами. По истечении 10 минут инкубации в каждую пробирку добавьте пять миллилитров реагента ТСА. Затем в каждую пробирку, включая холостую, добавьте соответствующий объем раствора фермента так, чтобы конечный объем раствора фермента в каждой пробирке составил один миллилитр.

Это делается для учета значения оптической плотности самого фермента. Теперь инкубируйте растворы при 30 °C в течение 30 минут. Во время этой 30-минутной инкубации можно подготовить разведения стандарта тирозина, используя шесть пробирок DR.

В эти шесть пробирок можно легко поместить по восемь миллилитров. Вводят стандартные стоковые растворы тирозина концентрацией 1,1 мМ в следующих объемах (в миллилитрах): 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 и 0,5. В холостую пробу стандарт тирозина не добавляют.

Для образцов теста на IPU, в которых ожидается незначительное изменение цвета, могут потребоваться стандарты с более низкой концентрацией. После добавления стандартного раствора тирозина добавьте в каждый стандарт соответствующий объем очищенной воды, чтобы довести общий объем до двух миллилитров. После инкубации профильтруйте каждый из тестовых растворов и холостую пробу.

С помощью шприцевого фильтра с порами 0,45 мкм два миллилитра испытуемых образцов и холостого фильтрата добавляют в четыре виалы DR объемом не менее восьми миллилитров. Можно использовать виалы того же типа, в которых готовились стандарты. Во все виалы, содержащие стандарты и стандартный холостой образец, добавляют пять миллилитров карбоната натрия, и для достижения наилучших результатов сразу после этого добавляют соответствующий реагент; затем карбонат натрия добавляют в испытуемые образцы и холостой образец. Заметьте, что после добавления карбоната натрия эти растворы становятся мутными.

Затем добавляется осаждающий реагент, который вступает в реакцию со свободным тирозином. После этого пробирки с DRAM перемешивают круговым движением и инкубируют при 37 °C в течение 30 минут. Вы должны заметить, что стандарты имеют градацию цвета, коррелирующую с количеством добавленного тирозина: образцы с наиболее высокими концентрациями тирозина будут иметь самый темный оттенок.

Также можно заметить значительное изменение цвета в наших тестовых образцах. Два миллилитра этих растворов фильтруют через шприцевой фильтр с порами 0,45 мкм в подходящие кюветы. Теперь, когда анализ завершен, перейдем к спектрофотометру и измерим значения оптической плотности.

Оптическая плотность наших образцов измеряют с помощью спектрофотометра при длине волны 660 нанометров. При длине оптического пути один сантиметр регистрируют значения абсорбции для стандартов, холостой пробы, различных исследуемых образцов и холостой пробы теста. После сбора всех данных мы приступаем к построению калибровочной кривой.

Для построения кривой необходимо рассчитать разницу в оптической плотности между стандартным раствором и соответствующим холостым контролем. Это значение оптической плотности обусловлено количеством тирозина в стандартных растворах. После этого простого расчета мы строим стандартную кривую, откладывая изменение оптической плотности стандартов по оси Y, а количество в микромолях для каждого из пяти стандартов — по оси X.

После ввода значений данных постройте линию наилучшего соответствия; затем определите изменение оптической плотности в исследуемых образцах, вычислив разницу между оптической плотностью исследуемого образца и оптической плотностью соответствующего холостого контроля. Используя стандартную кривую, найдите значение оптической плотности для одного из исследуемых образцов на оси Y. Затем, двигаясь параллельно оси X, проведите линию до точки пересечения со стандартной кривой.

Затем, используя значение координаты X, полученное в этой точке, мы определяем количество микромолей тирозина, высвободившегося в ходе данной конкретной протеолитической реакции. Для расчета активности фермента в единицах на миллилитр выполните следующие вычисления: возьмите количество эквивалентов микромолей тирозина, полученное по стандартной кривой, и умножьте его на общий объем анализа в миллилитрах, который в нашем случае составляет 11 миллилитров. Затем разделите полученное значение на три другие величины.

Время проведения анализа, который мы выполняли в течение 10 минут; объем фермента, использованного в анализе, который варьировался. Давайте возьмем один миллилитр. Объем в миллилитрах, используемый при колориметрическом определении, который может отличаться в зависимости от вашей кюветы.

Мы используем два миллилитра. Количество микромолей тирозина, разделенное на время в минутах, дает нам показатель активности протеазы, который мы называем единицами. Мы можем сократить единицы измерения объема в числителе и знаменателе, в результате чего получаем показатель активности фермента в единицах на миллилитр.

Чтобы определить активность в образце твердой протеазы, разведенном в разбавителе фермента, мы делим полученную активность в единицах на миллилитр на исходную концентрацию твердого вещества, использованного в данном анализе, в миллиграммах на миллилитр, что позволяет получить значение активности в единицах на миллиграмм. Таким образом, мы продемонстрировали, как анализировать активность протеазы с помощью универсального набора для определения активности протеазы от Sigma. Как вы заметили при выполнении данной процедуры, крайне важно помнить о необходимости медленного нагрева растворов казеина и тирозина и не доводить их до кипения.

Кроме того, крайне важно подготовить отдельные холостые пробы как для стандартов, так и для каждого исследуемого образца. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в определении протеазной активности.