In Vitro ядерной Ассамблеи Использование фракционированный яиц Xenopus Экстракты

Экстракты из яиц Xenopus laevis полезны в качестве цитоплазматического и органеллярного материала для восстановления в условиях in vitro таких клеточных событий, как сборка ядра и импорт ядерных белков. При добавлении ДНК хроматина сперматозоидов в неочищенные или фракционированные экстракты из яиц Xenopus laevis мембранные везикулы, присутствующие в экстракте, связываются с поверхностью хроматина, сливаются и встраивают компоненты ядерных пор, образуя полностью функциональные синтетические ядра. После этого становится возможным определение молекулярных основ этих процессов путем иммунодеплеции экстрактов и модификации белков.

Здравствуйте, меня зовут Мари Кросс, я аспирантка в лаборатории доктора Морин Пауэр на кафедре клеточной биологии Университета Эмори в Атланте, штат Джорджия. Сегодня мы покажем вам, как формировать ядра in vitro с использованием фракционированных экстрактов яиц ксенопуса. Эта процедура включает в себя следующие этапы: проведение реакции сборки ядра и оценка формирования ядер.

Приступим. Для начала сборки ядер возьмите аликвоту фракционированного цитозоля и добавьте фосфокреатин из 0,2 молярного стокового раствора до конечной концентрации 20 миллимоляр. Затем добавьте креатинкиназу из стокового раствора с концентрацией 5 мг/мл до конечной концентрации 50 мкг/мл.

Наконец, добавьте 20 µM A TP, используя стоковый раствор с концентрацией 0,2 M. Затем добавьте легкие мембраны в цитозоль в разведении 1:10. Это примерно соответствует количеству мембран, присутствующих в исходном сыром экстракте.

Смешайте все компоненты, перемешивая содержимое пипеткой вверх-вниз, чтобы распределить мембраны в экстракте. Это необходимо сделать до добавления хроматина сперматозоидов. Затем добавьте хроматин сперматозоидов в фракционированный экстракт в требуемой концентрации и немедленно перемешайте экстракт со спермой, осторожно перемещая жидкость пипеткой с обрезанным кончиком вверх-вниз.

При добавлении хроматина сперматозоидов в экстракт он немедленно начинает деконденсироваться, затем снова конденсироваться и становится подверженным сдвиговому разрушению. Как правило, такие реакции проводят в центрифужных пробирках объемом 500 µL, при этом общий объем реакционной смеси составляет менее 100 µL. Экстракты яйцеклеток поддерживают формирование до 8 000–9 000 структур.

Количество ядер на микролитр; инкубируйте смесь от одного до двух часов при комнатной температуре для формирования ядер. Ядра визуализируют с помощью окрашивания. Примерно через 30 минут вновь образовавшиеся ядра будут иметь небольшую овальную форму.

ДНК все еще остается достаточно конденсированной, и при наблюдении в УФ-канале по мере конденсации ДНК ядро должно выглядеть как сплошное светло-голубое пятно. Кроме того, голубое окрашивание станет менее однородным, и со временем начнут появляться черные промежутки. Формирование ядерной мембраны можно визуализировать, добавив в фиксатор один микрограмм на самца 3,3-диаминоциклогексанкарбоксимида или DHCC.

DHCC представляет собой флуоресцентный липофильный краситель, визуализация которого осуществляется в канале флуоресцеина. На ранних стадиях сборки ядер мембранные везикулы связываются с поверхностью хроматина и начинают сливаться участками. Это приводит к неравномерному и прерывистому виду формирующейся мембраны.

После завершения формирования мембрана разглаживается по поверхности ядра и выглядит как равномерный непрерывный ободок вокруг ДНК. В окружающем цитозоле будет наблюдаться значительная фоновая флуоресценция из-за мембранных везикул, которые не встроились в ядра. Мы только что продемонстрировали вам восстановление ядер in vitro с использованием растворимых и легких мембранных фракций экстракта яиц Xenopus.

Важно помнить, что неочищенный экстракт можно использовать для сборки ядер, но только до замораживания и последующего размораживания. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.