Использование лазерный пинцет для манипуляций Изолированные нейроны In Vitro

Ашкин первым продемонстрировал, что лазерные пинцеты или оптические ловушки являются мощным инструментом для манипулирования микроскопическими объектами живой природы. В этом видео мы покажем, как мы применили эту технологию для захвата и перемещения нейронов. Перед вами рабочая станция оптического пинцета.

Зеленые стрелки показывают путь лазерного луча через оптику микроскопа. Когда лазерный луч, сфокусированный объективом микроскопа, преломляется клеткой, сила, изменяющая направление светового луча, воздействует на клетку, перемещая ее к центру фокуса.

Это создает силу в несколько пиконьютонов, достаточную для перемещения клетки в среде. В данном видео мы обсудим изготовление чашек, подготовку клеток сетчатки, посев клеток в культуральные чашки, манипуляции с помощью лазерного пинцета и наблюдение за ростом клеток. Поскольку клетки прилипают к стеклу, нам потребовалось создать область, отталкивающую клетки, чтобы их можно было легко захватить пинцетом.

Половина чашки была покрыта poly hema — полимером, препятствующим прикреплению клеток. Другая половина была покрыта cell one — субстратом, который поддерживает рост наших клеток. Сначала на адгезивной стороне чашки идентифицируют клетку.

Затем другая клетка захватывается со стороны полимера и переносится на адгезивную сторону, где обе клетки соединяются в пару. Для подготовки чашек мы используем стерильные культуральные чашки Polystar диаметром 35 мм, очищенные с помощью обдува. Сначала мы проделываем в дне отверстие диаметром 1 см с помощью небольшого токарного станка или сверлильного пресса.

Возьмите очищенные кислотой покровные стекла и установите их вертикально в безпыльную среду, например, в вытяжной шкаф. Возьмите раствор polyus, растворенный в 95% спирте, и нанесите несколько капель в верхней части покровного стекла только на одну его половину. Дайте poly hema высохнуть. Пометьте сторону покровного стекла с нанесенным polyus.

Разместите уплотнитель S вокруг отверстия в дне чашки для культивирования. Приклейте покровное стекло к чашке с помощью уплотнителя S. Убедитесь, что полиамид находится внутри, а также проверьте отсутствие утечек через зазоры в уплотнителе.

Поместите покровное стекло так, чтобы край слоя poly hema проходил по центру чашки. Дайте чашке высохнуть в течение двух-трех дней, затем нанесите на дно чашки метки алмазным резцом, которые будут служить ориентирами для позиционирования чашки на предметном столике микроскопа. Поместите чашки в вытяжной шкаф и стерилизуйте их под воздействием ультрафиолетового излучения.

Нанесите одну или две капли раствора антител козы к US на сторону чашки без полиуса, стараясь не пролить раствор на полигемическое покрытие, и оставьте примерно на три часа. Удалите раствор и промойте стерильным раствором Рингера. Нанесите на ту же область раствор первичных антител к клеткам и инкубируйте в течение ночи, чтобы подготовить образец к эксперименту на следующий день.

Клетки в нашей лаборатории получены из сетчатки взрослых саламандр на водной фазе развития. Сетчатки диссецируют и извлекают, после чего подвергают ферментативному перевариванию. Затем изолированные клетки можно высеять в чашку для культивирования.

Глаза удаляют. Роговицу иссекают и удаляют. Глазное яблоко помещают в стерильный раствор Рингера.

Сетчатку отделяют от глазного яблока, аккуратно вынимая ее краем изогнутого пинцета. Диоксид углерода и кислород пропускают через раствор Рингера, содержащий пропан, после чего раствор стерилизуют с помощью ультратонкого фильтра с порами 0,2 micron. Сетчатки помещают в раствор фермента и подвергают перевариванию в течение примерно 40 минут при перемешивании для расщепления ткани.

После трехкратного промывания сетчатки подвергают диссоциации с помощью трипсина. Изолированные клетки собирают пипеткой с шариком диаметром 3 мм; теперь они готовы к посеву. Чашку с питательной средой помещают на предметный столик микроскопа и ориентируют соответствующим образом, используя метки на дне чашки.

Это позволяет в будущем в точности воспроизвести положение планшета. Затем клетки высевают на обе стороны планшета: на сторону с poly hema и на сторону cell one. Положение планшета на предметном столике микроскопа, а также мощность лазера регулируются с помощью джойстика.

Сначала мы определили клетку, прикрепившуюся к одной стороне чашки. Это мультиполярная клетка сетчатки, которую можно идентифицировать по ее дендритам. Координаты положения клетки были сохранены.

Это палочкообразная фоторецепторная клетка, находящаяся на стороне чашки с репеллентом для клеток polyus. Чашка опускается, лазер захватывает клетку и поднимает ее над дном чашки. Теперь клетка транспортируется в другую часть чашки к координатам мультиполярной клетки.

На самом деле клетка неподвижна. Двигается сама чашка. Сейчас клетка проходит через край полигемового покрытия.

Выступ, extending из клетки, представляет собой аксонный терминал. Клетка находится достаточно далеко от любого детрита и других клеток на дне чашки, которые могли бы препятствовать ее движению. На заднем плане видны расфокусированные изображения клеток на дне чашки.

Палочковая клетка перемещается к мультиполярной клетке и может быть точно расположена в нужной точке и на заданном расстоянии от нее. Чашку поднимают, и клетка прикрепляется к субстрату первой клетки. Основными преимуществами данной процедуры являются возможность выбора перемещаемых клеток и возможность проведения манипуляций в закрытой стерильной экспериментальной системе.

Межклеточные взаимодействия можно отслеживать с помощью видеозаписи с интервалом во времени или цифровой фотографии. Лазерный пинцет может быть использован в сочетании с любым биологическим методом. Здесь, например, метод флуоресценции демонстрирует наличие синаптических белков в точках контакта между клетками, перемещаемыми с помощью пинцета.