Патч зажим Запись ионных каналов, выраженные в ооцитов Xenopus

Эта процедура начинается с удаления мембраны вилина из Opus Cytes для успешного формирования устойчивых к гига-ому уплотнений, необходимых для записи патч-зажимов. После того, как конфигурация клеточного зажима получена, к пипетке может быть применена аспирация для получения электрического доступа к цитоплазме клетки в так называемой конфигурации всего клеточного пластыря. Затем кончик пипетки может быть оттянут от плазматической мембраны до тех пор, пока он не защелкнется, чтобы получить небольшой участок мембраны, где эктодомены каналов подвергаются воздействию раствора для ванны, это известно как конфигурация внешнего участка Go.Hi, я Остин Браун из лаборатории доктора Мириам Гудман на кафедре молекулярной и клеточной физиологии Стэнфордского университета.

Меня зовут Брэндон Джонсон, я тоже из лаборатории Гудмана. В предыдущем видео мы продемонстрировали, как изготавливать патч-зажимные пипетки и острые электроды для электрофизиологии. Сегодня мы представим введение в запись ионных каналов с помощью патч-клещей, выраженную в зпа.

Таким образом, с момента своего появления в Южном Сакраменто и Эйре в конце 1970-х годов, запись с помощью патч-зажима стала важным методом электрофизиологического измерения одиночных или множественных ионных каналов в клетках. Итак, приступим. Для того, чтобы пипетки с зажимом патча могли получить доступ к плазматической мембране ооцитов, внешняя мембрана вилина должна быть удалена.

Чтобы сделать это в первую очередь, подготовьте два комплекта щипцов номер пять. Слегка заточите один комплект щипцов напильником. Также приготовьте стеклянную пипетку для переноса, обрезав и отполировав огнем семидюймовую пастбищную пипетку, чтобы предотвратить соскальзывание цитов, вырежьте круг из сетки сетки, содержащей квадраты 0,8 миллиметра, и приклейте его на дно 60-миллиметровой чашки Петри.

Эту посуду можно использовать повторно неограниченное время, если содержать ее в чистоте между использованиями. Затем заполните чашку Петри наполовину раствором Гиперосмотического и поместите под препарирующий микроскоп. Теперь извлеките от одного до трех опус Цитов из их инкубационного раствора с помощью полированной пипетки, пипетки и поместите в чашку.

Подождите от 15 секунд до двух минут, пока циты не начнут сжиматься. По мере того, как они уменьшаются, мембрана вилина начинает становиться едва заметной в виде прозрачного слоя над цитой. Более длительное время облегчает отслаивание клетки, более короткое время приводит к более здоровым клеткам.

Для наложения повязки выберите здоровую ооцит без завихрений и дефектов для отшелушивания одной парой щипцов, аккуратно захватите мембрану вилина, не повреждая плазматическую мембрану, другим захватом около того же места и аккуратно с помощью обеих пар щипцов разорвите прозрачную мембрану и освободите ее от ооцита как единое целое. Далее с помощью пастбищной пипетки осторожно переместите ооцит в записывающую камеру. Учтите, что после удаления вилина клетка будет хрупкой.

Теперь, когда место ОК подготовлено, мы готовы сформировать высокопрочное уплотнение или гига-уплотнение между наконечником пипетки и мембраной ооцита. Для этого наполните записывающую пипетку физиологическим раствором. Используйте минимальный объем раствора, который обеспечивает хороший электрический контакт с электродным проводом, чтобы свести к минимуму емкость пипетки.

Затем несколько раз щелкните пипеткой, чтобы пузырьки всплыли. Наденьте пипетку на электродную проволоку и затяните держатель. Далее приложите положительное давление к наполненной пипетке с помощью пипетки со ртом.

Это давление имеет решающее значение для поддержания чистоты пипетки, когда она пересекает границу раздела жидкости и движется к ячейке. Теперь найдите цитиру в камере и резко сфокусируйтесь на краю ячейки с помощью пипетки из центра ванны. Расфокусированный кончик над ооцитом.

На этом этапе пипетка сводит к минимуму время, которое пипетка проводит в ванне до образования уплотнения, что помогает сохранить наконечник пипетки чистым от загрязнений из раствора. Затем опустите пипетку вниз в фокус рядом с ооцитом. Подведите его в непосредственной близости, примерно на 50 мкм.

С помощью программного обеспечения патч-зажима проверьте сопротивление пипетки. Целевое сопротивление составляет примерно от трех до шести мегаом. Затем обнулите ток с помощью смещения напряжения с положительным давлением на пипетку.

Медленно перемещайте наконечник к ячейке, следя за сопротивлением, когда кончик начнет касаться клетки. Сопротивление будет увеличиваться, когда наконечник будет соприкасаться с клеткой. Резко, но плавно переключайтесь с положительного на отрицательное давление примерно одинаковой абсолютной величины.

Сопротивление должно увеличиться и вызвать образование уплотнения. Обычно образование уплотнения происходит в течение нескольких секунд. Иногда требуется от 30 до 60 секунд.

Как только сопротивление достигает давления высвобождения в один гигаОм до нейтрали, у нас теперь есть патч на ячейке. Этот метод полезен для записей, в которых нормальная среда клетки, такая как цитоскелет, имеет решающее значение для функции ионных каналов. Однако ни внутренние, ни внешние решения не могут быть разнообразными.

На следующем этапе мы продемонстрируем, как сделать внешний внешний участок, который позволяет варьировать внешние решения для создания внешней топологии, разрывать мембрану сразу после достижения гига-герметизации. Для этого нужно подать импульс в один вольт на одну миллисекунду. Сопротивление должно упасть до уровня, немного превышающего исходное сопротивление пипетки.

Затем медленно и плавно отодвиньте пипетку от ячейки. Вы должны увидеть, как часть ячейки вытягивается пипеткой. В течение нескольких секунд ячейка внезапно отскочит назад, и сопротивление должно немедленно вернуться к собственному уровню гига.

Теперь у нас есть внешний участок в этой конфигурации, внешние домены любых включенных ионных каналов подвергаются воздействию ванны. Это необходимо для применения таких препаратов, как блокаторы, которые могут взаимодействовать только с внешними доменами канала. Мы только что продемонстрировали, как проводить запись ионных каналов, выраженных в ксеноби-цитах.

При выполнении этой процедуры важно отметить, что уплотнения с более высоким сопротивлением в диапазоне 10 гигаОм являются предпочтительными и более долговечными. По нашему опыту, надежное получение пломб такого качества зависит от многих факторов. К наиболее важным параметрам относятся использование качественных цитов с равномерной окраской, без завихрений и дефектов, быстрое отслаивание цитов с целью минимизации времени нахождения в усадочном растворе, вытягивание новых беспыльных пипеток в тот же день эксперимента и их полировка в течение часа после эксперимента, проверка путем осмотра, что пипетки гладкие и отполированные. Поддержание давления с момента подачи пипеток в ванну до образования уплотнения.

Ладно, вот и все. Спасибо за просмотр. Удачи в ваших экспериментах и удачного патчинга.