Создание Patch-пипетки и Sharp Электроды с программируемой Puller

Стеклянные капиллярные пипетки стали повсеместно использоваться в лабораториях для самых разных методов, таких как электропорация одиночных клеток, микроинъекция ДНК и электрофизиология патч-хомута. Наконечники электродов покрываются воском, а затем наконечники полируются огнём и хранятся для дальнейшего использования. Здравствуйте, меня зовут Мириам Гудман с факультета молекулярной и клеточной физиологии Стэнфордского университета.

В этом видео я покажу, как сделать патч-зажимные пипетки и острые электроды для электрофизиологии. Стеклянные микроэлектроды, также называемые пипетками, были рабочей лошадкой электрофизиологии на протяжении десятилетий. Сегодня эти пипетки изготавливаются из стеклянных капилляров с помощью программируемого вытягивания.

Итак, приступим. Для изготовления пипеток с патч-зажимом мы используем шелк кабана Sutter в чистых капиллярах и без пыли, а также съемник микроэлектродов Sutter P nine seven flameing ground. Sutter's Pipette Cookbook является отличным справочником для разработки подходящих программ вытягивания.

Для начала поднимите пылезащитную крышку на съемнике. Затем возьмите одну стеклянную капиллярную трубку из коробки. Обязательно установите крышку на место, чтобы свести к минимуму накопление пыли.

Далее одной рукой проденьте капилляр в паз с одной стороны нити, слегка затяните хомут. На этом этапе зажим должен быть достаточно плотным, чтобы предотвратить падение трубки, но достаточно слабым, чтобы вы могли протолкнуть его в паз. Теперь отпустите металлический упор пружины с той же стороны.

Затем большим и указательным пальцами возьмитесь за металлические язычки, которые прикреплены к нижней части обоих носителей. Отпустите другой металлический упор пружины. Стяните переноски вместе до упора и удерживайте на месте одной рукой.

Затем проденьте трубку через корпус филамента в паз держателя с другой стороны. Не проталкивайте стекло в нагревательную нить. Затяните хомуты с обеих сторон.

Они должны быть достаточно плотными, чтобы удерживать держатели на месте, но не настолько плотными, чтобы стекло не раздавилось. Теперь закройте пылезащитную крышку и нажмите зеленую кнопку. Пипетки с размеченными полюсами для записи с помощью патч-клещей формируются с помощью пятиступенчатой программы опроса с нисходящей теплотой и скоростью на каждом шаге и маленьким полюсом на последнем этапе.

В этой программе используются тепло и гравитация. Процедура изготовления острых электродов очень похожа, но в данном случае мы используем тонкий стеклянный капилляр от Warner Instruments, который имеет внешний диаметр один миллиметр и внутренний диаметр 0,78 миллиметра. Мы также применяем программу вытягивания, которая использует двигатель в дополнение к теплу и силе тяжести после завершения программ вытягивания.

Поднимите пылезащитную крышку, ослабьте оба зажима и снимите готовую пипетку. Затем поместите пипетки в рабочую коробку. Коробку можно изготовить, приклеив полоску пенопласта к стойке пластиковой коробки для наконечника для пипетки, а затем вырезав в пене шесть-восемь щелей.

Вставьте пипетки в щели. Как только коробка наполнится вынутыми пипетками, перейдите к этапу огневой полировки для огневой полировки пипеток. Перед началом огневой полировки установите микрокузнечную установку с платиновой нагревательной нитью, управляемой ножной педалью.

Сначала покройте пипетку стоматологическим воском, чтобы снизить емкость и улучшить шумовые характеристики. Для этого держите рядом небольшой запас расплавленного воска. Надавливайте воздухом на заднюю часть пипетки, чтобы воск не попал на наконечник

Затем ненадолго окуните кончик в жидкий воск. И удалить сейчас. Поместите пипетку в полировальный аппарат и подведите наконечник примерно на 50 микрон от нити.

Имейте в виду, что при нагревании нить будет расширяться. Нанесите короткий тепловой импульс в течение одной или двух секунд, чтобы удалить воск с кончика пипетки и разгладить стекло. Рассмотрите наконечники пипеток под микроскопом, чтобы определить диаметр и гладкость отверстия.

Для стандартной записи патч-зажима отверстия наконечников должны быть от одного до трех микрон в диаметре, отброшенные, шероховатые, неровные или неровные кончики. Поместите готовую пипетку в рабочую коробку, обязательно закрыв крышку, чтобы защитить пипетки от пыли и повторите 10 успешных пипеток. Я только что показал вам, как делать патч-зажимные пипетки и острые электро с помощью программируемого съемника.

Та же процедура может быть использована для изготовления различных стеклянных инструментов, включая инъекционные иглы для достижения оптимальных результатов зажима пластыря. Важно помнить о том, что в тот же день эксперимента нужно вытащить новые беспыльные пипетки и отполировать их в течение часа после эксперимента. Также убедитесь, что пипетки гладкие и отполированы.

Обязательно посмотрите другое наше видео, в котором показано, как выполнить запись с помощью патч-хомута ионных каналов, выраженных в ооцитах опуса. Ладно, вот и все. Теперь вы являетесь экспертом в области пипеток и желаете удачи в ваших экспериментах.