Давление полировки Пипетки для улучшения Патч-зажим Запись
22 октября 2008 г.
Это руководство к изменению формы из стекла микропипетки. В частности, с помощью тепла и давления воздуха конус расширяется без увеличения наконечник открытие, что приводит к снижению сопротивления пипетки. Это очень важно для получения низких записи шума из мелких клеток, но полезно во многих приложениях.
Эта процедура начинается с размещения наконечника пипетки рядом с полировочной нитью при 100-кратном увеличении. Далее включите давление воздуха и нагрев. Нить.
Кончик пипетки расширится, образуя тупой кончик. Выключите огонь, чтобы получить меньшее отверстие кончика. Выключите давление и снова нагрейте.
Здравствуйте, я Брэндон Джонсон из лаборатории доктора Мириам Гудман на кафедре молекулярной и клеточной физиологии Стэнфордского университета. Сегодня мы покажем вам процедуру полировки под давлением патч-пипетками. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения ионных каналов и мембранных патчей, а также нейронов NC elgan.
Итак, приступим. Возьмите набор из шести-10 патч-пипеток. Обратитесь за помощью к местному специалисту или в наш визуализированный эксперимент по изготовлению патч-пипеток и острых электродов с программируемым поляром.
Чтобы начать процедуру, установите давление сжатой воздуховоды примерно на 40 PS. Затем я подсоединяю сжатую воздуховоду к четырехходовому регулирующему клапану. Подсоедините отрезок пластиковой трубки к четырехходовому клапану и прикрепите держатель пипетки высокого давления к свободному концу пластиковой трубки. Используйте микрокузнечную установку для выполнения полировки.
Мы используем набор Ccpm two от LA Scientific. Этот стенд оснащен держателем для пипеток высокого давления, платиновой нагревательной нитью, управляемой ножной педалью, и микроскопом, оснащенным малым и большим увеличением в 10 раз в 100 раз. Воздушные цели для рабочего расстояния идеальны, поскольку крайне важно иметь возможность наблюдать за отверстием пипетки во время протокола.
Затем убедитесь, что клапан давления находится в выключенном положении. Затем поместите пипетку в держатель пипетки и плотно затяните фитинг для обеспечения безопасности лаборатории. Убедитесь, что пипетка надежно закреплена в держателе пипетки.
В противном случае давление воздуха приведет к тому, что пипетка будет выброшена из держателя. В качестве дополнительного шага вы можете покрыть пипетку гидрофобным изолятором, таким как воск, чтобы уменьшить емкость и улучшить шумовые характеристики. Теперь поместите пипетку в держатель в микрокузницу, расположите держатель пипетки на предметном столике микроскопа так, чтобы и наконечник, и полировальная нить были видны при низкой в 10 раз мощности на микрокузнечном горне.
Подведите наконечник примерно на 50 микрон от нити, затем переключитесь на объектив высокой мощности 100, оба наконечника пипетки и полировальная нить должны быть в фокусе и в поле зрения. Если нет, отрегулируйте высоту нити. Поскольку положение пипетки не может быть отрегулировано, наконечник пипетки и нить накала должны находиться на противоположных сторонах поля зрения.
Не располагайте наконечник пипетки слишком близко к нити накала, так как при нагревании он расширится и может врезаться в пипетку. После того, как наконечник и нить будут правильно расположены, поверните клапан, чтобы направить сжатый воздух в пипетку, и нагрейте наконечник пипетки до тех пор, пока конус за наконечником не начнет раздуваться наружу. Прекратите нагрев, пока наконечник не раздулся слишком сильно.
Необходимы эксперименты, чтобы определить подходящее расстояние, тепло и время для желаемой формы. В качестве дополнительного шага вы также можете отполировать наконечник при отсутствии давления, чтобы уменьшить диаметр отверстия наконечника. Кроме того, имейте в виду, что эти шаги полировки можно повторять до мелочения.
Настройте форму и размеры наконечника для дозатора. Когда полировка будет завершена. Выключите точку давления на наконечнике пипетки в безопасном направлении.
Извлеките пипетку и поместите ее в чистую коробку для хранения, где она будет защищена от пыли. В целях безопасности лаборатории обязательно выключите давление перед извлечением пипетки. В противном случае он может быть выброшен из держателя пипетки.
После снятия мы только что показали вам, как полировать пипетки давлением для улучшения записи с помощью патч-фикса. При выполнении этой процедуры важно не забывать покрывать полировальный змеевик стеклом с высокой температурой плавления, чтобы свести к минимуму отложение испарившегося металла на пипетках. И соблюдать осторожность во время воздействия на пипетки сжатого воздуха.
Убедитесь, что пипетка надежно удерживается в держателе, и выключите воздух, прежде чем извлекать пипетку из держателя. Вот и все. Спасибо за просмотр.
Удачной полировки давлением и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном руководстве подробно описывается модификация формы стеклянных микропипеток с помощью нагрева и давления воздуха. Этот процесс позволяет расширить конус, не увеличивая диаметр отверстия кончика, что крайне важно для получения записей с низким уровнем шума при работе с малыми клетками.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Электрофизиология
- Изготовление микропипеток
Теоретические основы
- Стеклянные микропипетки являются важнейшими инструментами при проведении электрофизиологических записей.
- Для получения высококачественных записей необходимо низкое сопротивление пипетки.
- Изменение формы пипетки может улучшить ее эффективность в различных областях применения.
- Данный метод особенно полезен при записи сигналов с малых клеток.
Цель исследования
- Предложить метод формирования стеклянных микропипеток.
- Снизить сопротивление пипетки без увеличения диаметра отверстия наконечника.
- Повысить качество записей от малых клеток.
Используемые методы
- Позиционирование кончика пипетки рядом с полировальной нитью при большом увеличении.
- Подача давления воздуха и нагрев для расширения кончика пипетки.
- Отключение нагрева для получения меньшего отверстия кончика.
- Заключительная регулировка путем отключения давления и нагрева.
Основные результаты
- Кончик пипетки можно эффективно переформовать в тупую форму.
- Достигается более низкое сопротивление без увеличения размера кончика.
- Данный метод повышает качество регистрации сигналов из малых клеток.
- Продемонстрирован практический подход к модификации микропипетки.
Выводы
- Изготовление стеклянных микропипеток является ценным методом в нейробиологических исследованиях.
- Улучшенная конструкция пипетки способствует повышению качества данных.
- Данный метод может быть применен в различных электрофизиологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Полировка пипеток под давлением снижает электрическое сопротивление при записях методом патч-клампа без изменения диаметра кончика, что позволяет с более высокой точностью измерять ионные каналы в небольших популяциях нейронов. Это техническое улучшение способствует валидации мишеней при поиске новых нейротропных препаратов за счет повышения соотношения сигнал/шум в электрофизиологических анализах. Повышение качества записи увеличивает прогностическую достоверность ранних механистических исследований возбудимости нейронов и синаптической функции.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функции ионных каналов в нейронах малого диаметра, которые имеют решающее значение для изучения мишеней при нейропатической боли и эпилепсии.
- Практическая ценность: снижает вариативность при записях одиночных каналов за счет минимизации шума, вызванного пипеткой.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает создание стандартизированной геометрии пипеток для получения воспроизводимых результатов при электрофизиологическом скрининге.
- Практическая ценность: Совместимость как с мягким, так и с жестким стеклом микропипеток, что позволяет гибко проектировать анализы для различных классов мишеней.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Облегчает применение метода локальной фиксации потенциала с перфорацией мембраны за счет создания тупых кончиков пипеток, что увеличивает образование мембранных выпячиваний при использовании антибиотиков-перфорантов.
- Практическая ценность: Увеличивает продолжительность регистрации в первичных культурах нейронов, повышая производительность исследований по оптимизации соединений-лидеров.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в рабочие процессы раннего этапа поиска лекарственных средств, где электрофизиологическое фенотипирование служит основой для выбора мишени и профилирования соединений-лидеров.
- Биология открытий: обеспечивает функциональную валидацию мишеней ионных каналов в релевантных для заболеваний нейрональных моделях.
- Скрининг: предоставляет пипетки с низким сопротивлением для высокоточного скрининга соединений на платформах патч-кламп.
- Аналитика: позволяет получать количественные измерения тока и проводимости с повышенной стабильностью сигнала.
- Трансляционные исследования: облегчают проведение лонгитюдных записей в острых срезах и культивируемых нейронах для фармакокинетического и фармакодинамического моделирования.
- Корпоративное использование: требует только модернизации микрокузницы, что делает этот метод масштабируемым и недорогим способом совершенствования существующей инфраструктуры электрофизиологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишени за счет получения более четких электрофизиологических фенотипов.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость анализа между различными центрами и операторами за счет стандартизации геометрии пипеток.
- Стратегическая ценность: Снижает количество ложноотрицательных результатов при скрининге ионных каналов за счет минимизации технического шума.
- Влияние на портфель: Обосновывает решения о продолжении или прекращении (go/no-go) доклинических программ, направленных на изучение возбудимости нейронов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с микропипетками и знания в области электрофизиологии.
- Необходим микрофорж с клапаном высокого давления, нагревательной нитью и оптикой с увеличением.
- Требуется стандартизация параметров давления, нагрева и времени для всех пользователей.
- Необходимо учитывать различия в типе стекла (натрий-кальциевое по сравнению с боросиликатным) при полировке.
- Возможности ограничены необходимостью ручного позиционирования кончика и навыками оператора для предотвращения избыточного расширения.
