Давление полировки Пипетки для улучшения Патч-зажим Запись
22 октября 2008 г.
Это руководство к изменению формы из стекла микропипетки. В частности, с помощью тепла и давления воздуха конус расширяется без увеличения наконечник открытие, что приводит к снижению сопротивления пипетки. Это очень важно для получения низких записи шума из мелких клеток, но полезно во многих приложениях.
Данная процедура начинается с позиционирования наконечника пипетки рядом с полирующей нитью при 100-кратном увеличении. Затем включите подачу воздуха и нагрев. Нить.
Кончик пипетки расширится, образуя затупленный конец. Выключите нагрев, чтобы уменьшить отверстие кончика. Снова отключите подачу давления и нагрев.
Здравствуйте, я Брэндон Джонсон из лаборатории доктора Мириам Гудман с кафедры молекулярной и клеточной физиологии Стэнфордского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру полировки патч-пипеток под давлением. В нашей лаборатории мы используем эту процедуру для изучения ионных каналов и мембранных патчей в нейронах *C. elegans*.
Итак, приступим. Возьмите набор из 6–10 патч-пипеток. Для получения дополнительной информации обратитесь к местному специалисту или просмотрите наш видеоэксперимент по изготовлению патч-пипеток и острых электродов с помощью программируемого тягача.
Для начала процедуры установите давление в линии сжатого воздуха примерно на 40 PS.I, затем подсоедините линию сжатого воздуха к четырехходовому регулирующему клапану. Подсоедините отрезок пластиковой трубки к четырехходовому клапану, а к свободному концу трубки прикрепите держатель для пипеток высокого давления. Для проведения полировки используйте установку микрокузнечного оборудования.
Мы используем комплект Ccpm two от компании LA Scientific. Данная установка оснащена держателем для пипеток высокого давления, платиновым нагревательным элементом, управляемым ножной педалью, и микроскопом, оснащенным объективами с малым и большим увеличением (10x и 100x) и большим рабочим расстоянием. Такие объективы идеальны, поскольку в ходе протокола крайне важно иметь возможность наблюдать за отверстием пипетки.
Далее убедитесь, что выпускной клапан находится в закрытом положении. Затем поместите пипетку в держатель для пипеток и затяните соединение вручную до упора в целях обеспечения безопасности в лаборатории. Убедитесь, что пипетка надежно зафиксирована в держателе.
В противном случае из-за давления воздуха пипетка вылетит из держателя. В качестве дополнительного шага вы можете покрыть пипетку гидрофобным изолятором, например воском, чтобы снизить емкость и улучшить шумовые характеристики. Теперь поместите пипетку в держатель в положение микрокузницы, установив держатель пипетки на предметный столик микроскопа так, чтобы и кончик, и полировочная нить были видны при малом увеличении (10-кратном) в микрокузнице.
Подведите кончик дозировочной трубки примерно на 50 мкм к полирующей нити, затем переключитесь на объектив 100 с высокой апертурой; и кончик пипетки, и полирующая нить должны находиться в фокусе и в поле зрения. Если это не так, отрегулируйте высоту нити. Поскольку положение пипетки не регулируется, кончик пипетки и нить должны располагаться по противоположным сторонам поля зрения.
Избегайте размещения кончика дозатора слишком близко к нити, так как при нагревании она расширяется и может задеть дозатор. После правильного позиционирования кончика и нити поверните клапан, чтобы направить сжатый воздух в дозатор, и нагревайте его кончик до тех пор, пока конус за кончиком не начнет раздуваться. Прекратите нагрев до того, как кончик раздуется слишком сильно.
Для достижения желаемой формы необходимо провести серию экспериментов, чтобы определить подходящее расстояние, температуру нагрева и время воздействия. В качестве дополнительного этапа вы также можете отполировать кончик без приложения давления, чтобы уменьшить диаметр отверстия кончика. Кроме того, имейте в виду, что эти этапы полировки можно повторять для более точной подгонки.
Отрегулируйте форму и размеры наконечника пипетки. По завершении полировки отключите подачу давления и направьте наконечник пипетки в безопасную сторону.
Извлеките пипетку и поместите ее в чистый контейнер для хранения, чтобы защитить ее от пыли. В целях безопасности в лаборатории обязательно отключите подачу давления перед извлечением пипетки. В противном случае она может вылететь из держателя.
Итак, мы продемонстрировали вам способ полировки пипеток под давлением для улучшения качества записей методом патч-клампа. При выполнении этой процедуры важно не забыть покрыть полировочную спираль стеклом с высокой температурой плавления, чтобы минимизировать осаждение испаренного металла на пипетках. Также следует соблюдать осторожность, пока пипетки подвергаются воздействию воздуха под давлением.
Убедитесь, что пипетка надежно зафиксирована в держателе, и отключите подачу воздуха перед тем, как извлечь пипетку из держателя. На этом всё. Спасибо за просмотр.
Желаем успехов в проведении полировки под давлением и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном руководстве подробно описывается модификация формы стеклянных микропипеток с помощью нагрева и давления воздуха. Этот процесс позволяет расширить конус, не увеличивая диаметр отверстия кончика, что крайне важно для получения записей с низким уровнем шума при работе с малыми клетками.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Электрофизиология
- Изготовление микропипеток
Теоретические основы
- Стеклянные микропипетки являются важнейшими инструментами при проведении электрофизиологических записей.
- Для получения высококачественных записей необходимо низкое сопротивление пипетки.
- Изменение формы пипетки может улучшить ее эффективность в различных областях применения.
- Данный метод особенно полезен при записи сигналов с малых клеток.
Цель исследования
- Предложить метод формирования стеклянных микропипеток.
- Снизить сопротивление пипетки без увеличения диаметра отверстия наконечника.
- Повысить качество записей от малых клеток.
Используемые методы
- Позиционирование кончика пипетки рядом с полировальной нитью при большом увеличении.
- Подача давления воздуха и нагрев для расширения кончика пипетки.
- Отключение нагрева для получения меньшего отверстия кончика.
- Заключительная регулировка путем отключения давления и нагрева.
Основные результаты
- Кончик пипетки можно эффективно переформовать в тупую форму.
- Достигается более низкое сопротивление без увеличения размера кончика.
- Данный метод повышает качество регистрации сигналов из малых клеток.
- Продемонстрирован практический подход к модификации микропипетки.
Выводы
- Изготовление стеклянных микропипеток является ценным методом в нейробиологических исследованиях.
- Улучшенная конструкция пипетки способствует повышению качества данных.
- Данный метод может быть применен в различных электрофизиологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Полировка пипеток под давлением снижает электрическое сопротивление при записях методом патч-клампа без изменения диаметра кончика, что позволяет с более высокой точностью измерять ионные каналы в небольших популяциях нейронов. Это техническое улучшение способствует валидации мишеней при поиске новых нейротропных препаратов за счет повышения соотношения сигнал/шум в электрофизиологических анализах. Повышение качества записи увеличивает прогностическую достоверность ранних механистических исследований возбудимости нейронов и синаптической функции.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функции ионных каналов в нейронах малого диаметра, которые имеют решающее значение для изучения мишеней при нейропатической боли и эпилепсии.
- Практическая ценность: снижает вариативность при записях одиночных каналов за счет минимизации шума, вызванного пипеткой.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает создание стандартизированной геометрии пипеток для получения воспроизводимых результатов при электрофизиологическом скрининге.
- Практическая ценность: Совместимость как с мягким, так и с жестким стеклом микропипеток, что позволяет гибко проектировать анализы для различных классов мишеней.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Облегчает применение метода локальной фиксации потенциала с перфорацией мембраны за счет создания тупых кончиков пипеток, что увеличивает образование мембранных выпячиваний при использовании антибиотиков-перфорантов.
- Практическая ценность: Увеличивает продолжительность регистрации в первичных культурах нейронов, повышая производительность исследований по оптимизации соединений-лидеров.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в рабочие процессы раннего этапа поиска лекарственных средств, где электрофизиологическое фенотипирование служит основой для выбора мишени и профилирования соединений-лидеров.
- Биология открытий: обеспечивает функциональную валидацию мишеней ионных каналов в релевантных для заболеваний нейрональных моделях.
- Скрининг: предоставляет пипетки с низким сопротивлением для высокоточного скрининга соединений на платформах патч-кламп.
- Аналитика: позволяет получать количественные измерения тока и проводимости с повышенной стабильностью сигнала.
- Трансляционные исследования: облегчают проведение лонгитюдных записей в острых срезах и культивируемых нейронах для фармакокинетического и фармакодинамического моделирования.
- Корпоративное использование: требует только модернизации микрокузницы, что делает этот метод масштабируемым и недорогим способом совершенствования существующей инфраструктуры электрофизиологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишени за счет получения более четких электрофизиологических фенотипов.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость анализа между различными центрами и операторами за счет стандартизации геометрии пипеток.
- Стратегическая ценность: Снижает количество ложноотрицательных результатов при скрининге ионных каналов за счет минимизации технического шума.
- Влияние на портфель: Обосновывает решения о продолжении или прекращении (go/no-go) доклинических программ, направленных на изучение возбудимости нейронов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с микропипетками и знания в области электрофизиологии.
- Необходим микрофорж с клапаном высокого давления, нагревательной нитью и оптикой с увеличением.
- Требуется стандартизация параметров давления, нагрева и времени для всех пользователей.
- Необходимо учитывать различия в типе стекла (натрий-кальциевое по сравнению с боросиликатным) при полировке.
- Возможности ограничены необходимостью ручного позиционирования кончика и навыками оператора для предотвращения избыточного расширения.
