Overview
Source : Laboratoires du Dr Ian poivre et Dr Charles Gerba - Université de l’Arizona
Auteur mettant en évidence : Bradley Schmitz
Sol compose de la mince couche à la surface de la terre, contenant les facteurs biotiques et abiotiques qui contribuent à la vie. La partie non biologique comprend des particules inorganiques variant en taille et en forme qui déterminent la texture du sol. La portion biotique incorpore les résidus végétaux, racines, matières organiques et micro-organismes. Diversité et l’abondance des microbes du sol est large, car un seul gramme de sol contient 107-8 bactéries, actinomycètes 106-8 , 105-6 champignons, 103 levure, 10 protozoaires de4-6 , 10 algues3-4 et 53 nématodes. Les facteurs biotiques et abiotiques forment ensemble des architectures autour des racines des plantes, appelées la rhizosphère, qui offrent des conditions favorables pour les micro-organismes du sol.
Les facteurs biotiques et abiotiques promouvoir la vie dans les sols. Toutefois, elles contribuent aussi stressante dynamique qui limitent les microbes. Les stress biotiques implique une concurrence entre vie à adapter et à survivre dans des conditions environnementales. Par exemple, les microbes peuvent sécréter des substances toxiques ou inhibitrices pour nuire voisine de micro-organismes. Penicillium notatum est un champignon notoire, car elle réduit la compétition pour les nutriments en produisant un antimicrobien, lesquelles les humains récoltent pour créer la pénicilline pharmaceutique. Aux stress abiotiques proviennent des propriétés physiques ou chimiques limitant la survie microbienne, comme la lumière, humidité, température, pH, éléments nutritifs et texture.
Principles
Directement observer les interactions entre les organismes du sol, des particules et des comportements au sein de la variable d’environnement est difficile, mais le dosage de contact de glissement, également connu sous le nom la technique enterré-slide, développé par Rossi et al. (1936) fournit un point de vue instantané en microbiologie des sols. Cette méthode est utile pour l’observation des champignons du sol, actinomycètes et bactéries par microscopie. Bien que, il n’est pas conçu pour les analyses quantitatives microbiennes, telle qu’elle implique seulement une petite partie d’un plus grand environnement hétérogène.
Cette méthode est facilement effectuée en enterrant une lame de verre dans le sol pendant plusieurs jours, puis en fixant les microorganismes sur la lame avec de l’acide acétique. Les microbes sont colorés avec un colorant Rose Bengale et observées par microscopie d’immersion dans l’huile sur l’objectif X 100. Trois groupes microbiens se distingués, comme bactéries apparaissent sous forme de petites formes arrondies, actinomycètes filaments comme des cordes fines et des hyphes fongiques comme fils épais. Dans le sol, presque toutes les bactéries sont plus petites et plus rondes que celles en culture pure à cause du stress nutritionnel, ce qui provoque le rétrécissement et arrondi pour une surface plus favorable : rapport volumétrique. Les formes irrégulières de sombres ne pas colorées sont les particules du sol. Différentes modifications des éléments nutritifs peuvent être ajoutées au sol pour fournir des sources de carbone et de glucose qui favorisent les interactions et la croissance microbienne. Cette technique permet une observation facile de la microbiologie des sols et permet d’identifier plusieurs organismes présents dans l’environnement.
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Procedure
1. sol microcosme préparation
- Recueillir le sol de jardin de la surface (0-6 "profondeur), et peser 150 g de sol dans deux tasses distinctes.
- Si le sol a haute densité de la matière organique, peser 100 g.
- Une tasse de l’étiquette « traitement » et l’autre « contrôle. »
- Calculer la quantité d’eau nécessaire pour modifier la teneur en humidité.
- Teneur en eau est souvent à proximité de la capacité au champ.
- Teneur en eau est souvent à proximité de la capacité au champ.
- Quantité de mesure d’eau distillée avec une éprouvette graduée.
- Versez la quantité d’eau distillée dans deux flacons.
- Étiquette un flacon « Traitement » et l’autre « contrôle. »
- Modifier l’eau dans le flacon de « Traitement » avec suffisamment de glucose pour une concentration de glucose sol finale de 1 %, selon une base de poids sec dans le sol de « Traitement ».
- Ajouter 200 mg NH4NO3 dans le flacon de « Traitement » et remuez pour dissoudre les modifications. Le nitrate sert de source d’azote de nutriments pour les microbes du sol.
- Modifier pas le flacon de « Contrôle ».
- Dans de petites parties aliquotes d’environ 50 mg, mélanger le contenu de la fiole de « Traitement » dans la tasse de « Traitement ». Remuez avec une spatule après chaque addition aliquote.
- Dans de petites parties aliquotes, mélanger le contenu de la fiole de « Contrôle » dans la tasse de « Contrôle ». Remuez avec une spatule après chaque addition aliquote.
- Étiquette de quatre lames de microscope propre : deux « traitement » et deux lames de « Contrôler ».
- Insérez les deux glissières de « Traitement » dans la coupe de sol « Traitement » et insérer les deux glissières de « Contrôle » dans la coupe de sol « Control ». Laisser 2 cm de chaque diapositive projetant au-dessus de la surface du sol et n’oubliez pas de laisser un espace entre les deux glissières.
- Couvrir les coupes d’une pellicule plastique et le fixer avec un élastique.
- Perforer l’enveloppe plusieurs fois pour permettre à l’air, mais toujours éviter une évaporation excessive.
- Noter le poids de deux tasses.
- Incuber les tasses remplies de sol à température ambiante dans une zone désignée/incubateur pendant 7 jours.
2. faire glisser la coloration et la microscopie
- Noter le poids de deux tasses.
- Calculer l’humidité du sol au moment de l’enlèvement de la diapositive.
- Retirez les deux glissières de chaque tasse en appuyant sur chaque diapositive pour une position inclinée et en retirant donc la face supérieure de la lame n’est pas perturbée.
- Identifier et marquer le côté de la diapositive à être colorés et observés.
- Tapotez doucement les diapositives sur le dessus de banc pour éliminer les saletés importantes.
- À l’aide d’un essuie-tout humide, nettoyer la face inférieure des diapositives. Sécher les lames à température ambiante.
- Portant des lunettes de protection et tenant chaque diapositive avec une pince, plonger les lames dans 40 % (v/v) d’acide acétique pendant 1-3 min sous une hotte aspirante.
- Nettoyez l’excès d’acide sous un léger courant d’eau.
- À l’aide d’un compte-gouttes, couvrir la surface des lames avec phénoliques Rose Bengale. Soutenir la diapositive sur une coloration grille au-dessus d’un récipient pour attraper la tache d’excès. Attention, ne pas laver avec une force qui peut supprimer les micro-organismes de la surface des lames.
- Tache les diapositives pour 5-10 min. ne laissez pas la diapositive devenir sec. Ajouter une tache plus que nécessaire.
- Laver délicatement les lames pour enlever tache excédentaire.
- Laissez que les lames sécher à température ambiante.
- À l’aide de l’objectif à immersion d’huile, observer la diapositive à l’aide d’un microscope (Figure 1).
La figure 1. Une lame sous un microscope.
Les relations entre les différents organismes et composants inorganiques dans le sol sont essentielles à la compréhension des changements de sol et les contraintes environnementales, mais ne peut pas être élucidées sans visualisation directe.
Sol, un système extrêmement complexe, est un habitat pour des millions d’organismes divers. La région du sol directement autour des racines des plantes en particulier, appelé la rhizosphère, contient un tableau unique d’organismes qui sont directement influencés par les racines des plantes.
La composante non biologique ou non biologique, de la rhizosphère comprend des particules inorganiques variant en taille et en forme qui contribuent à la texture du sol. La partie biologique, ou biologique, inclut les résidus végétaux, racines, matières organiques et micro-organismes.
Cette vidéo fera la démonstration de la visualisation directe des composants biotiques et abiotiques de la rhizosphère, afin de comprendre les facteurs qui influent sur les changements de sol et de prédire les stress environnementaux.
Organismes microscopiques ont tendance à résider dans l’eau situé à l’intérieur des pores du sol. Les bactéries sont parmi les plus simples et plus abondants organismes présent dans le sol et sont retrouvent dans plusieurs morphologies, y compris les sphères appelées coques, tiges appelées bacilles et formes filamenteuses.
Espèces de champignons, tels que les levures et les moisissures, sont les organismes deuxième plus abondants dans le sol. Ils travaillent pour décomposer et recycler la matière organique morte. Des champignons microscopiques filamenteux visuellement diffèrent des autres micro-organismes, qu’ils possèdent des hyphes longues et ramifiées qui libèrent des spores.
L’observation directe des relations entre ces organismes est difficile, mais peut être réalisée à l’aide d’un essai de contact de glissement. Cette méthode est exécutée en plongeant une lame de verre dans le sol pendant plusieurs jours et en autorisant les organismes et les saletés s’adsorber sur la surface de glissement.
La lame est ensuite retirée en biais pour éviter les bavures de la surface. Les microbes sont fixées avec de l’acide acétique et colorés avec tache Rose Bengale pour permettre la visualisation par l’intermédiaire de la microscopie photonique.
Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent la technique de dosage de diapositive contact, permet de prendre un regard sur le processus en laboratoire.
Tout d’abord, recueillir des sols de jardin surface et transférer le sol dans le laboratoire. Peser 150 g de sol dans les 2 récipients distincts. Un récipient doit être étiqueté comme l’échantillon de traitement, ce qui modifiera les nutriments afin d’encourager la prolifération rapide des organismes. Étiqueter l’autre comme le contrôle qui sera inchangé.
Calculer la teneur en eau dans le sol, en utilisant la technique décrite dans détermination de la teneur de cette collection en humidité sol vidéo. Selon ce calcul, déterminez la quantité d’eau dans le sol sur la base du poids sec. Maintenant calculer la quantité d’eau qui devra être ajouté pour donner une teneur en humidité du sol de 15 %. Cela amène l’humidité à la capacité au champ, optimale pour la croissance de micro-organisme.
Mesurer la quantité calculée de l’eau distillée à l’aide d’une éprouvette graduée. Versez le volume calculé d’eau dans chaque récipient. Basée sur le poids sec préalablement déterminé du sol, calculer la quantité de glucose nécessaire pour atteindre une concentration de glucose sol finale de 1 % en masse, à l’aide de la base du poids sec. Peser cette quantité de glucose et ajoutez-le au conteneur de traitement seulement.
Peser 200 mg de nitrate d’ammonium, puis ajoutez-le au conteneur de traitement seulement. Le nitrate d’ammonium sert comme source de nutriments azotée pour les microbes du sol. Mélanger le mélange du sol, de glucose et de nitrate d’ammonium dans le conteneur.
Ensuite, l’étiquette 4 lames de microscope propre : 2 comme traitement et deux en tant que contrôle. Insérer les diapositives de deux traitements dans le récipient de sol de traitement. Laisser une partie de chaque diapositive exposé au-dessus de la surface du sol et s’assurer qu’il y a un écart entre les deux glissières.
Insérer les diapositives de deux contrôle dans le conteneur de contrôle sol de la même manière. Couvrir les coupes d’une pellicule plastique et fixer avec un élastique. Perforer l’enveloppe en plastique plusieurs fois pour permettre le transfert de l’air, mais toujours éviter une évaporation excessive.
Enfin, les deux tasses de peser, noter leur poids et les incuber dans une zone désignée à température ambiante pendant sept jours.
Après l’incubation de sept jours, calculer la teneur en humidité du sol en pesant les coupes du sol. Déterminer si le poids a été perdue en raison de l’évaporation de l’eau et remplacez l’eau si nécessaire.
Retirer la pellicule de plastique du contenant et enlever les deux glissières du sol en appuyant sur chaque diapositive pour une position inclinée et en retirant afin que la face supérieure de la lame est intacte.
Tapotez doucement les diapositives pour éliminer les saletés importantes. À l’aide d’un essuie-tout humide, nettoyer la face inférieure des diapositives. Laissez-les sécher à température ambiante sous une hotte. Une fois sec, ramasser une diapositive avec une pince et le plonger dans l’acide acétique pendant 1 à 3 min.
Rincez la partie supérieure de la lame avec un léger courant d’eau distillée pour enlever l’excès d’acide. Répétez ces étapes pour toutes les diapositives. Laisser les lames à l’air sec.
Soutenir la diapositive sur une coloration grille au-dessus d’un récipient pour attraper le colorant excédentaire. À l’aide d’un compte-gouttes, couvrir délicatement la surface de la lame avec de la teinture de Rose Bengale phénolique. Laisser les lames de colorer pendant 5 à 10 min, en prenant soin d’ajouter plus de colorant au besoin pour tenir les diapositives mouillés. Délicatement rincer les lames avec de l’eau pour enlever la tache excédentaire et laisser les lames sécher à température ambiante.
Examiner les diapositives sous un microscope optique, à l’aide d’un objectif à immersion d’huile. Le sol traité auront plus de microbes du sol.
Les interactions spatiales entre les organismes fongiques et bactériennes dans les échantillons de sol type peuvent facilement être visualisées. Les particules du sol affichent des formes irrégulières sombres.
Organismes fongiques montrent des hyphes filamenteux épais, tandis qu’actinomycètes affichent minces hyphes filamenteux.
Les bactéries se trouvent comme petite cocci ou formes tige, généralement en touffes, sur les particules du sol ou la doublure d’hyphes fongiques.
L’isolement direct des organismes du sol est important pour la compréhension des caractéristiques du sol et de l’environnement.
Les nématodes entomopathogènes sont microscopiques rond vers qui parasitent les insectes. Alors qu’ils ne sont pas visualisées dans l’essai de contact de glissement, ils peuvent être isolés dans des échantillons de sol collectés, comme illustré dans cet exemple.
Tout d’abord, les nématodes ont été appâtés dans le sol à l’aide d’insectes identifiés à partir d’un examen visuel. Les nématodes ont été isolées de l’appât d’insectes morts, en plaçant les insectes morts dans un environnement humide et sombre et permettant les nématodes migrent hors de l’eau environnante. Les nématodes ont été prélevés dans l’eau puis analysés.
Champignons filamenteux sont essentiels à la santé en raison de leur rôle dans le recyclage des éléments nutritifs du sol. L’isolement et l’observation de champignons filamenteux du sol a été réalisée dans cet exemple.
Des échantillons de sol ont été dilués avec de l’eau et ajoutés pour séparer les boîtes de gélose stériles Rose Bengale streptomycine. La streptomycine a empêché la croissance bactérienne et a permis la croissance fongique. Colonies fongiques ont été comptées et montées sur une lame de verre à l’aide de ruban adhésif. Les champignons ont été projetés puis à l’aide d’un microscope optique.
Les microorganismes du sol décomposent naturellement de composants dans le sol, comme les plantes mortes et organismes. Biodégradation et colonisation des films plastiques biodégradables ont été examinées, comme illustré dans cet exemple.
Les champignons ont été isolés de films plastiques enfouis dans le sol pendant plusieurs mois. Les champignons ont ensuite été testées individuellement pour la croissance sur des films plastiques. Films plastiques sont ensuite incubées avec la souche fongique sélectionnée avec aucun support de croissance, afin d’observer la dégradation directe du plastique par les champignons.
Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à l’analyse de contact de glissement pour l’imagerie qualitative des microbes du sol. Vous devez maintenant comprendre comment préparer la lame de contact et visualiser les microbes du sol. Merci de regarder !
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Results
Champignons d’affichage épais hyphes filamenteux (Figure 2). Actinomycètes affichent hyphes minces et filamenteuses. Bactéries présentent de petites cocci ou formes de tige. On les retrouve souvent en touffes, sur les particules du sol, ou doublure hyphes fongiques. Les particules de sol affichent formes irrégulières, sombres (Figure 3).
La figure 2. Contact image de diapositive à l’aide de la lentille d’objectif X 100.
Photo courtoisie W.H. Fuller.
La figure 3. Contact image de diapositive à l’aide de la lentille d’objectif X 100.
Photo courtoisie W.H. Fuller.
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Applications and Summary
L’essai de contact diapositive, également dénommé le slide enterré, est une technique simple utilisée pour observer qualitativement biote du sol. Cet essai montre qualitativement les interactions spatiales entre les hyphes fongiques, filaments d’actinomycètes, bactéries et saletés. Individus ou industrie peut employer ce dosage pour recueuillir des connaissances sur la santé du sol notamment en ce qui concerne l’agriculture, jardinage, compostage, enseignant et étudiant. Cependant, cette technique ne quantifie pas micro biote du sol, comme il comprend seulement un petit portrait d’un plus grand environnement hétérogène.
Relations de sol organisme peuvent être observées par la réalisation de l’essai de contact de glissement et d’affichage des résultats par le biais de 100 X huile d’immersion la microscopie (Figures 2 et 3). La simplicité et la facilité de réalisation de cet essai rend une grande technique de départ pour ceux qui n’ont jamais été exposés à la microbiologie et peuvent être des micro-organismes Regarde un microscope pour la première fois.
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References
- Pepper, I. L., & Gerba, C P. 'Contact Slide Assay.' Environmental Microbiology A Laboratory Manual. 2nd ed. Elsevier 19-25 (2004).
- Pepper, I. L., Gerba, C. P., & Gentry, T. J. 'Earth Environments.' Environmental Microbiology. 3rd ed. Elsevier 59-88 (2014).
- Rossi, G., Ricardo, S., Gesue, G., Stanganelli, M., and Want, T.K. Direct Microscopic and bacteriological investigations of the soil. Soil Science. 41, 52 – 66 (1936).
