Analyse des courbes de croissance bactérienne et ses Applications pour l’environnement

Environmental Microbiology

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Overview

Source : Laboratoires du Dr Ian poivre et Dr Charles Gerba - Université de l’Arizona
Démonstration d’auteur : Luisa Ikner

Les bactéries sont parmi les formes de vie les plus abondants sur terre. Ils sont trouvent dans chaque écosystème et sont vitales pour la vie quotidienne. Par exemple, les bactéries affect, ce que les gens mangent, boivent et respirer, et il y a effectivement plus de bactéries dans le corps d’une personne que les cellules de mammifères. En raison de l’importance des bactéries, il est préférable d’étudier certaines espèces de bactéries dans le laboratoire. Pour ce faire, les bactéries sont cultivées dans des conditions contrôlées en culture pure, ce qui signifie que seulement un type de bactérie est à l’étude. Les bactéries se développent rapidement en culture pure, et nombre de cellules augmente considérablement dans un court laps de temps. En mesurant le taux de population cellulaire augmenter au fil du temps, une « courbe de croissance » à développer. C’est important quand visant à utiliser ou à inoculer des nombres connus de la souche bactérienne, par exemple améliorer la croissance des plantes, augmenter la biodégradation des composés organiques toxiques ou produire des antibiotiques ou autres produits naturels à l’échelle industrielle.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Essentiels de la microbiologie environnementale. Analyse des courbes de croissance bactérienne et ses Applications pour l’environnement. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

Reproduction bactérienne s’effectue par fission binaire, dans lequel une cellule bactérienne se divise et devient deux cellules (Figure 1). Le temps nécessaire à la division cellulaire est connu comme la génération moyenne durée ou temps de doublement, c'est-à-dire le temps nécessaire pour le nombre de cellules à double.

Figure 1
Figure 1. La division cellulaire exponentielle. Chaque division cellulaire se traduit par un doublement du nombre de cellules. Au nombre de cellules faible, l’augmentation n’est pas très grande ; Cependant après quelques générations, cellule numérote l’augmentation explosive. Après n divisions, il y a 2 cellules den .

Pour comprendre et définir la croissance des micro-organismes particuliers, ils sont placés dans une fiole, où l’approvisionnement en éléments nutritifs et les conditions environnementales sont contrôlées. Si le milieu liquide fournit tous les nutriments nécessaires pour la croissance et les paramètres environnementaux propices à la croissance, l’augmentation des nombres peut être mesurée en fonction du temps afin d’obtenir une courbe de croissance. Plusieurs phases de croissance distincts peuvent être observés dans une courbe de croissance (Figure 2). Il s’agit de la phase de latence, l’exponentielle ou phase logarithmique, la phase stationnaire et la phase de mort, dont chacune est liée à des modifications physiologiques spécifiques (tableau 1).

Phase de Caractéristiques
Phase de latence Croissance lente ou absence de croissance en raison de l’adaptation physiologique des cellules aux conditions de culture ou d’une dilution des exoenzymes en raison de la faible densité initiale.
Exponentielle ou Log Phase Taux de croissance optimal, au cours de laquelle nombre de cellules double à intervalles de temps discrets, connus comme la durée d’une génération moyenne.
Phase stationnaire Croissance (division cellulaire) et la mort des cellules contrebalancent l’autre entraîneraient aucune augmentation nette dans le nombre de cellules. Le taux de croissance réduit est généralement due à un manque d’éléments nutritifs ou une accumulation de constituants des déchets toxiques.
Phase de mort Taux de mortalité dépasse le taux de croissance, ce qui entraîne une perte nette de cellules viables.

Table 1. Les quatre phases de la croissance bactérienne.

Figure 2
Figure 2. Une courbe de croissance typique pour une population bactérienne. Comparer la forme des courbes issu des formatrices unités (UFC) par rapport à la densité optique, en particulier dans la phase de mort. La différence est due au fait que les cellules mortes encore le résultat de la turbidité, mais ne peuvent pas constituer des colonies viables dans la culture.

Dans l’ensemble, il est souvent essentiel pour déterminer la cinétique de croissance bactérienne pour une souche bactérienne donnée, afin de connaître le nombre de cellules bactériennes présentes dans le milieu liquide. Il y a différentes façons de mesurer la croissance en milieu liquide, y compris les mesures de turbidité à l’aide d’un spectrophotomètre colorimétrique et bordé de dilution en série. Mesures de turbidité s’appuient sur le fait que les cellules plus présent dans le milieu liquide, la plus trouble que le liquide devient. Placage de dilution en série consiste à doser le nombre de cellules dans le milieu liquide qui forment des colonies viables sur la solide culture, une mesure dite « unités formant des colonies » de la culture. Notez, cependant, que ces tests de placage utilisable uniquement pour les bactéries qui sont, en fait, cultivable.

Procedure

<>

1. collecte des aliquotes de Culture bactérienne

  1. Un jour avant la collection de points de croissance de temps, inoculer 20 mL de milieu de bouillon (BST) trypticase soja dans un ballon jaugé de 50 mL à e. coli.
  2. Incuber pendant la nuit à 27 ° C. Cette période d’incubation relativement longue se traduit par une population de phase stationnaire de type sauvage e. coli d’environ 109 UFC/mL.
  3. Le jour suivant, utilisez 100 µL de la culture préparée pour inoculer 250 mL du BST (dans un ballon jaugé de 500 mL). Mélanger soigneusement.  Supprimer une partie aliquote de 5 mL et réfrigérer immédiatement à 4 ° C. Il s’agit de T = 0 ou0 le moment T et devrait contenir environ 4 x 105 UFC/mL.
  4. Placer le ballon de l' autres e. coli (245 mL) dans un 37 ° C, secouant l’incubateur. Retirer les aliquotes de 5 mL de la culture toutes les heures, jusqu'à 8 h. stocker chaque aliquote à 4 ° C. Désigner ces parties aliquotes T1 à T8.

2. les dilutions

  1. Retirer les aliquotes d’e. coli du réfrigérateur et la place sur la glace pour le transport. Garder toutes les cultures sur la glace jusqu'à l’utilisation.
  2. Mettre en place une série de tubes de dilution pour obtenir diverses dilutions de chaque culture d’e. coli (Figure 3). Microtubes sont commodes pour cette fonction. Chaque tube de dilution doit avoir 900 µL de liquide de dilution (physiologique). Une série de dilution est nécessaire pour chaque culture d’e. coli (T0 à T8) ; Etiqueter chaque tube selon le tableau 2.
    Figure 3
    La figure 3. Schéma montrant la procédure pour l’électrodéposition d’e. coli.
  3. Commencer les dilutions en ajoutant 100 µL d’e. coli du tube étiqueté T0 (la première culture d’e. coli ) au tube A, qui correspond à la dilution 10-1 T0. Vortex le tube pendant 5 s.
  4. Par la suite, ajouter 100 µL de Tube A au prochain tube de sérum physiologique, Tube B, qui correspond à la dilution de 10-2 T0. Continuer la série de dilution nécessaire pour chaque aliquote de point de temps. N’oubliez pas de vortex chaque avant de tube de transfert. Il est également important d’utiliser un nouvel embout de la pipette pour chaque transfert.
Culture d’e. coli Dilutions nécessaires et Tube #
A B C D E F G
T0 10-1 10-2
T1 10-1 10-2
T2 10-1 10-2 10-3
T3 10-1 10-2 10-3 10-4
T4 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
T5 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
T6 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
T7 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
T8 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Le tableau 2. Série de dilution requise pour chaque culture d’e. coli .

3. placage

  1. Trois dilutions pour chaque aliquote point d’e. coli culture temps vont être plaquées, selon le tableau 3. Étiquette des assiettes avec le point dans le temps (T1 à T8), le facteur de dilution et le volume à ajouter. Utiliser des plaques en triple pour chaque dilution.
  2. Ajouter 100 µL de chaque dilution à la plaque en pipettant également, le montant au centre de la gélose (Figure 3). Répandre immédiatement l’aliquote en utilisant une flamme stérilisés « L » en forme de baguette de verre. Si l’aliquote ne se transmet pas immédiatement, il s’absorbe in situ sur la plaque, ce qui entraîne la prolifération bactérienne à l’endroit d’inoculation initiale.
  3. Répétez l’électrodéposition pour chaque série de dilution pour temps points T1 à T8. N’oubliez pas de stériliser la tige entre les plaques et surtout entre les différentes dilutions.
  4. Une fois que les plaques ont séché pendant quelques minutes, retournez et placer dans incubateur à 37 ° C pendant la nuit. Inversant les plaques empêche la condensation de tomber sur la gélose. Après incubation pendant la nuit, des plaques doivent être conservés au réfrigérateur.
E. coli culture Dilutions à être plaqué
T0 10-1 10-2 10-3
T1 10-1 10-2 10-3
T2 10-2 10-3 10-4
T3 10-3 10-4 10-5
T4 10-4 10-5 10-6
T5 10-5 10-6 10-7
T6 10-6 10-7 10-8
T7 * 10-5 10-6 10-7
T8 * 10-4 10-5 10-6

* Les dilutions inférieures tiennent compte des populations inférieures à cause de phase de mort.

Tableau 3. Bordé de protocole pour les cultures d’e. coli .

4. comptage de Colonies et en calculant la durée d’une génération moyenne

  1. Examiner les plaques pour l’uniformité des colonies et l’absence de contamination.
  2. Pour chaque point du temps (T0 à T8), choisir une dilution qui contient entre 30 et 300 colonies et plaques en triple de numération.
  3. En utilisant le facteur de dilution, dos-calculer le nombre de cellules / mL de culture d’origine à la fois points T0 à T8. Par exemple, si le nombre de colonies résultant d’une dilution de 10-4 est de 30, 28 et 32 :
    Nombre moyen de colonies = 30 colonies
    Ceux-ci résultent de 0,1 mL d’une dilution de 10-4
    Nombre de colonies par mL = 30 x 104 = 3 x 106
  4. Tracer le journal10 UFC/mL par rapport au temps (en heures).
  5. Sur le graphique, d’identifier la phase exponentielle de croissance. À l’aide de 2 points dans le temps dans la phase de croissance exponentielle et le nombre de cellules correspondant à chaque époque, calculer la durée d’une génération moyenne.

Mesurer le taux de croissance des bactéries est une technique de microbiologie fondamentale et a usage répandu dans la recherche fondamentale ainsi que dans les applications agricoles et industrielles.

Les bactéries sont parmi les formes de vie les plus abondants sur terre, étant présents dans chaque écosystème, y compris le corps humain. Certaines espèces bactériennes sont également génétiquement très docile et ont été exploités comme modèles de recherche ou pour fabriquer des produits naturels ou synthétiques à l’échelle industrielle. Cependant, pas toutes les espèces bactériennes peuvent être cultivées en laboratoire. Pour ceux qui peuvent, une caractéristique importante est le taux de multiplication, ou « cinétique de croissance ».

Mesurer le taux de croissance de la culture bactérienne peut informer les scientifiques sur leur physiologiques et métaboliques fonctionne et est également utile pour obtenir un nombre précis de cellules de la bactérie pour applications en aval.

Cette vidéo présentera les principes qui sous-tendent l’analyse du taux de croissance bactérienne, démontrer un protocole pour caractériser les taux de croissance avec une « courbe de croissance » et enfin, découvrir plusieurs applications de sciences de l’environnement pour mesurer la cinétique de croissance bactérienne.

Bactéries généralement se reproduisent asexuellement, multipliant par scissiparité simple où une seule cellule parentale se divise en deux cellules-filles identiques. Dans des conditions de croissance favorables où les nutriments sont disponibles en abondance et les paramètres environnementaux tels que la température sont tous propices à la croissance, le taux de multiplication dépasse de loin le taux de mortalité. Cela se traduit par une croissance exponentielle.

En mesurant la quantité de bactéries dans une culture en fonction du temps, une courbe de croissance peut être obtenue. Les bactéries dans un milieu de culture liquide dans des conditions optimales de croissance produit une courbe de croissance avec une forme caractéristique qui peut être divisée en différentes phases. La courbe commence par une « phase de latence », quand la croissance est lente, tandis que les bactéries deviennent acclimatés à des conditions de culture. Suivant est le « journal » ou « phase exponentielle de croissance », quand les bactéries connaître une croissance exponentielle. La croissance cale finalement une fois l’épuisement nutriments et déchets s’accumulent, ce qui entraîne une « phase stationnaire ». Enfin, une fois que le taux de multiplication est dépassé par le taux de mort cellulaire, la culture pénètre dans la « phase de mort ».

Pour construire une courbe de croissance, le nombre de bactéries dans un flacon de culture liquide est comptés à différents moments sur une certaine période de culture. La numération bactérienne peut être obtenue par un certain nombre de différentes méthodes. Une approche courante consiste à mesurer la densité optique - ou « OD » - 600, qui est l’absorbance de la solution bactérienne de la lumière à une longueur d’onde de 600 nm.

Une autre méthode consiste à déterminer le « UFC », ou les unités formant des colonies par millilitre de la culture. En raison de la nature clonale de la croissance bactérienne, une bactérie dans une culture peut théoriquement développer dans une colonie observable sur une gélose. Par une série de dilutions d’une culture bactérienne de placage pour atteindre une concentration bactérienne où les colonies discrets peuvent être observés, une méthode appelée « plating dilution en série », la numération des colonies peut être utilisée pour le dos-calculer la concentration bactérienne en termes d’UFC / mL.

Maintenant que vous comprenez comment la croissance bactérienne peut être analysée, Let ' s go via un protocole pour effectuer une analyse de courbe de croissance sur les cultures pures d’un modèle bien établi bactérien, Escherichia coli, à l’aide de l’électrodéposition méthode de dilution en série.

Un jour avant l’heure point collection, inoculer 20 mL de bouillon préstérilisé trypticase soja ou du BST, moyen dans un ballon jaugé de 50mL avec une seule colonie d’Escherichia coli.

Incuber la culture pendant une nuit à 37 ° C sous agitation. Pour e. coli, cela se traduirait par une population de phase stationnaire d’environ 109 UFC/mL.

Le lendemain, ensemencer 100 μL de la culture au jour le jour dans 250 mL de BST dans un ballon jaugé de 500 mL. Mélanger soigneusement. Il en résulte une culture diluée d’environ 4 x 105 UFC/mL. Stocker 5 mL de cette culture diluée dans un tube à culture. Il s’agit de l’aliquote de temps point 0 ou T0. Réfrigérer immédiatement à 4 ° C.

Incuber le volume restant de la culture à 37 ° C sous agitation. À toutes les heures par la suite pendant 8 h, recueillir des aliquotes de 5 mL de la culture. Désigner ces échantillons T1 T8et stocker la totalité d'entre eux à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.

Le jour de l’expérience, enlevez les aliquotes de point de temps d’e. coli du réfrigérateur et mettez-les sur la glace. Microtubes stériles, chacune avec 900 μL de sérum physiologique stérile, permet de mettre en place une série de dilution pour chaque aliquote conformément au tableau suivant.

Mélange la culture de0 T bien au doucement Vortex, puis ajouter 100 μL de Tube A sa série de dilution, en faisant un 1 sur 10 ou 10-1 dilution. Tube de Vortex A mix, et à l’aide d’un embout de la pipette frais, ajouter 100 μL de Tube A du Tube B, faire le 1-en-100 ou 10-2 dilution.

Répétez le processus pour chaque culture aliquote et font de la série de dilution appropriée selon le tableau 2. Une fois la série de dilution pour tous les échantillons de point de temps ont été faites, le nombre de plaques d’agar stérile trypticase soja ont préparé pour ensemencement bactérien.

3 dilutions de chaque culture de point du temps vont être plaquées en trois exemplaires conformément au tableau suivant. Étiqueter les plaques en conséquence. Puis, pipette 100 μl de chaque culture convenablement dilué vers le centre de la gélose respectifs. Flamme-stériliser une baguette de verre en forme de « L ", cool en touchant la tige à l’agar loin de l’inoculum et immédiatement étaler le liquide sur la surface de la gélose. Veuillez noter que pourrait entraîner un retard dans la diffusion de la pullulation microbienne à l’endroit de l’inoculation.

Continuer l’électrodéposition de chaque série de dilution pour tous 9 fois point de cultures, le verre tige entre chaque série de dilution de propagation de flamme-stérilisation.

Une fois que les plaques ont été autorisés à sécher pendant quelques minutes, retournez et placez-les dans l’incubateur à 37 ° C pendant la nuit. Après cette période de croissance, les plaques peuvent être stockés à 4 ° C.

Après une nuit d’incubation des plaques dilution, examinez-les pour la contamination et l’uniformité des colonies. Pour chaque fois point culture, choisir une dilution pour laquelle il y a entre 30-300 colonies par boîte. Compter le nombre de colonies sur chacune des plaques en triple pour cette dilution.

En utilisant le nombre moyen de colonies pour chaque dilution et le facteur de dilution, calculer la concentration de bactéries dans la culture d’origine à chaque instant en UFC/mL. Par exemple, s’il y a en moyenne 30 colonies de la triple plaque ensemble issu de 0,1 mL de la 10-4, au 1-à-10 000, dilution, puis il serait 30 divisé par 0,1 mL multiplié par 10 000, soit 3 millions CFU/mL.

À l’aide de la concentration bactérienne calculée pour chaque point dans le temps, tracer la courbe du journal de la base 10 de la concentration bactérienne, en UFC/mL, contre le temps en heures. Sur le graphique, d’identifier la phase logarithmique de croissance de la culture d’origine bactérienne et de choisir deux points temps dans la phase logarithmique, qualifiant le premier de ces points dans le temps t = 0. Calculer la durée d’une génération moyenne à l’aide de l’équation X est égal à 2 à la puissance n multiplié par X0 où X est la concentration de bactéries au temps t, X0 est la concentration initiale à t = 0, et n est le nombre de générations qui s’est écoulé entre les deux points de temps.

Par exemple, supposons que X0 est 1 000 UFC/mL et à t = 6 h, que la concentration est de 16 000 UFC/mL. À l’aide de l’équation, nous obtenons que 4 générations ont eu lieu dans les 6 h, ce qui donne un temps de génération de 6 divisé par 4 ou 1,5 h par génération.

Mesure de la cinétique de croissance bactérienne est fondamentale pour de nombreuses applications pour la recherche, l’agriculture ou des fins de bio-ingénierie.

Une utilisation pour connaître le taux de croissance bactérienne est d’autoriser un montant précis d’une culture bactérienne à obtenir pour ensemencer une autre culture ou moyen. Par exemple, certaines cultures, comme les légumineuses, ont besoin d’être cultivées avec des bactéries symbiotiques connus comme les rhizobiums qui colonisent les racines de plantes à former des nodosités et « fixent » l’azote - convertir l’azote atmosphérique en ammoniac, qui peut être utilisé par la plante. Pour des applications agricoles, une quantité connue de rhizobiums est ajoutée à une moyenne de carbone à base de tourbe, qui est ensuite utilisé pour ensemencer les graines de légumineuses pour établir la symbiose plante-bactérie.

Analyse de la croissance permet également d’identifier les espèces bactériennes qui peuvent dégrader les déchets industriels et éventuellement générer des sous-produits utiles. Dans cet exemple, les chercheurs ont étudié comment les milieux de culture additionnés de la liqueur noire, un déchet de pâte de bois et la production de papier, affecté la croissance d’une souche microbienne environnementale.

Les bactéries non seulement démontré une croissance accrue avec la liqueur noire, mais ont également montrent un modèle de croissance « diphasique », indiquant la présence de plus d’une source de carbone dans la liqueur noire que les bactéries peuvent métaboliser. Les composants individuels de la liqueur noire pourraient alors été extraits pour plus d’analyse de la croissance.

Enfin, les mesures de taux de croissance sont également utiles pour caractériser les bactéries qui ont été conçus à des fins industrielles particulières, par exemple, pour l’assainissement de la pollution par les hydrocarbures. Ici, les scientifiques ont créé des souches de bactéries génétiquement modifiées qui contiennent des enzymes pour dégrader les composants d’hydrocarbures de pétrole. Analyse de la croissance a été réalisée, par exemple, pour vérifier que la bactérie machinée a augmenté les taux de croissance que les bactéries normales en présence des hydrocarbures toxiques, ce qui indique une tolérance accrue qui permettra les bactéries machinées de remplir leur fonction de nettoyage de la pollution.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur l’analyse des taux de croissance bactérienne avec des courbes de croissance. Vous devez maintenant comprendre les différentes phases de croissance des cultures bactériennes, comment réaliser une expérience afin d’obtenir une courbe de croissance à l’aide de la collection de points de temps et le placage de dilution en série, et comment l’analyse de la croissance peut être appliqué à des fins industrielles et de recherche. Comme toujours, Merci pour regarder !

Results

Suite à une dilution sérielle, expérience de placage, les données suivantes a été obtenues. Au début de la croissance exponentielle, désignée ici comme le temps t = 0, la concentration initiale des cellules bactériennes est de 1 000 UFC/mL. Au temps t = 6 h, la concentration des cellules est de 16 000 UFC/mL.

Maintenant, X = 2n x X0

Où : X0 = concentration initiale de cellules = 1 000 UFC/mL
X = concentration de cellules après le temps t = 16 000 UFC/mL
n = nombre de générations
16 000 = 2n x 1,000
2n = 16
Ouvrez une session10 2n = log10 16
n x 0,301 = 1,204
n = 1,204 = 4
0,301

Quatre générations s’est écoulé à 6 h, alors

Génération de temps moyen = 6/4 = 1,5 h.

Figure 4
La figure 4. Un nodule de racine qui contient des bactéries fixatrices d’azote.

Applications and Summary

Connaissance des numéros de cinétique et de bactéries de la croissance bactérienne dans un milieu de culture est important à la fois une recherche et un point de vue commercial. Dans la recherche, il est souvent essentiel de connaître le nombre de bactéries dans un échantillon, donc l’expérience peut être reproduite, si nécessaire, avec les mêmes numéros exacts. Par exemple, au cours d’expériences dans lesquelles des inoculants bactériens sont ajoutés à une parcelle de terre, un minimum de 104 UFC doit être ajouté par gramme de sol pour obtenir l’effet désiré, comme a amélioré la biodégradation des polluants des sols organiques toxiques. Un autre exemple est le cas du produit commercialement Rhizobiales inoculants, où les nombres connus des rhizobiums (bactéries qui entrent dans des relations symbiotiques avec les racines des plantes) sont imprégnés dans un milieu de carbone à base de tourbe (Figure 4). Le support est ensuite utilisé pour ensemencer les graines de légumineuses pour améliorer la fixation biologique de l’azote (par exemple, la conversion de l’azote moléculaire en formes organiques qui peut être utilisé par des organismes comme nutriments).

Cinétique de croissance est également utile pour déterminer si les souches particulières de bactéries sont adaptées à métaboliser certains substrats, tels que les déchets industriels ou de la pollution par les hydrocarbures. Les bactéries qui sont génétiquement modifiées pour nettoyer les déversements de pétrole, par exemple, peuvent être cultivés en présence d’hydrocarbures complexes pour s’assurer que leur croissance ne serait pas être réprimée par les effets toxiques de l’huile. De même, la pente et la forme des courbes de croissance produite à partir de bactéries cultivées avec des mélanges de déchets industriels peuvent informer scientifiques que les bactéries peuvent métaboliser la matière, et comment de nombreuses sources d’énergie potentielles pour les bactéries se trouvent dans le mélange des déchets.

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1. collecte des aliquotes de Culture bactérienne

  1. Un jour avant la collection de points de croissance de temps, inoculer 20 mL de milieu de bouillon (BST) trypticase soja dans un ballon jaugé de 50 mL à e. coli.
  2. Incuber pendant la nuit à 27 ° C. Cette période d’incubation relativement longue se traduit par une population de phase stationnaire de type sauvage e. coli d’environ 109 UFC/mL.
  3. Le jour suivant, utilisez 100 µL de la culture préparée pour inoculer 250 mL du BST (dans un ballon jaugé de 500 mL). Mélanger soigneusement.  Supprimer une partie aliquote de 5 mL et réfrigérer immédiatement à 4 ° C. Il s’agit de T = 0 ou0 le moment T et devrait contenir environ 4 x 105 UFC/mL.
  4. Placer le ballon de l' autres e. coli (245 mL) dans un 37 ° C, secouant l’incubateur. Retirer les aliquotes de 5 mL de la culture toutes les heures, jusqu'à 8 h. stocker chaque aliquote à 4 ° C. Désigner ces parties aliquotes T1 à T8.

2. les dilutions

  1. Retirer les aliquotes d’e. coli du réfrigérateur et la place sur la glace pour le transport. Garder toutes les cultures sur la glace jusqu'à l’utilisation.
  2. Mettre en place une série de tubes de dilution pour obtenir diverses dilutions de chaque culture d’e. coli (Figure 3). Microtubes sont commodes pour cette fonction. Chaque tube de dilution doit avoir 900 µL de liquide de dilution (physiologique). Une série de dilution est nécessaire pour chaque culture d’e. coli (T0 à T8) ; Etiqueter chaque tube selon le tableau 2.
    Figure 3
    La figure 3. Schéma montrant la procédure pour l’électrodéposition d’e. coli.
  3. Commencer les dilutions en ajoutant 100 µL d’e. coli du tube étiqueté T0 (la première culture d’e. coli ) au tube A, qui correspond à la dilution 10-1 T0. Vortex le tube pendant 5 s.
  4. Par la suite, ajouter 100 µL de Tube A au prochain tube de sérum physiologique, Tube B, qui correspond à la dilution de 10-2 T0. Continuer la série de dilution nécessaire pour chaque aliquote de point de temps. N’oubliez pas de vortex chaque avant de tube de transfert. Il est également important d’utiliser un nouvel embout de la pipette pour chaque transfert.
Culture d’e. coli Dilutions nécessaires et Tube #
A B C D E F G
T0 10-1 10-2
T1 10-1 10-2
T2 10-1 10-2 10-3
T3 10-1 10-2 10-3 10-4
T4 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
T5 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
T6 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
T7 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
T8 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Le tableau 2. Série de dilution requise pour chaque culture d’e. coli .

3. placage

  1. Trois dilutions pour chaque aliquote point d’e. coli culture temps vont être plaquées, selon le tableau 3. Étiquette des assiettes avec le point dans le temps (T1 à T8), le facteur de dilution et le volume à ajouter. Utiliser des plaques en triple pour chaque dilution.
  2. Ajouter 100 µL de chaque dilution à la plaque en pipettant également, le montant au centre de la gélose (Figure 3). Répandre immédiatement l’aliquote en utilisant une flamme stérilisés « L » en forme de baguette de verre. Si l’aliquote ne se transmet pas immédiatement, il s’absorbe in situ sur la plaque, ce qui entraîne la prolifération bactérienne à l’endroit d’inoculation initiale.
  3. Répétez l’électrodéposition pour chaque série de dilution pour temps points T1 à T8. N’oubliez pas de stériliser la tige entre les plaques et surtout entre les différentes dilutions.
  4. Une fois que les plaques ont séché pendant quelques minutes, retournez et placer dans incubateur à 37 ° C pendant la nuit. Inversant les plaques empêche la condensation de tomber sur la gélose. Après incubation pendant la nuit, des plaques doivent être conservés au réfrigérateur.
E. coli culture Dilutions à être plaqué
T0 10-1 10-2 10-3
T1 10-1 10-2 10-3
T2 10-2 10-3 10-4
T3 10-3 10-4 10-5
T4 10-4 10-5 10-6
T5 10-5 10-6 10-7
T6 10-6 10-7 10-8
T7 * 10-5 10-6 10-7
T8 * 10-4 10-5 10-6

* Les dilutions inférieures tiennent compte des populations inférieures à cause de phase de mort.

Tableau 3. Bordé de protocole pour les cultures d’e. coli .

4. comptage de Colonies et en calculant la durée d’une génération moyenne

  1. Examiner les plaques pour l’uniformité des colonies et l’absence de contamination.
  2. Pour chaque point du temps (T0 à T8), choisir une dilution qui contient entre 30 et 300 colonies et plaques en triple de numération.
  3. En utilisant le facteur de dilution, dos-calculer le nombre de cellules / mL de culture d’origine à la fois points T0 à T8. Par exemple, si le nombre de colonies résultant d’une dilution de 10-4 est de 30, 28 et 32 :
    Nombre moyen de colonies = 30 colonies
    Ceux-ci résultent de 0,1 mL d’une dilution de 10-4
    Nombre de colonies par mL = 30 x 104 = 3 x 106
  4. Tracer le journal10 UFC/mL par rapport au temps (en heures).
  5. Sur le graphique, d’identifier la phase exponentielle de croissance. À l’aide de 2 points dans le temps dans la phase de croissance exponentielle et le nombre de cellules correspondant à chaque époque, calculer la durée d’une génération moyenne.

Mesurer le taux de croissance des bactéries est une technique de microbiologie fondamentale et a usage répandu dans la recherche fondamentale ainsi que dans les applications agricoles et industrielles.

Les bactéries sont parmi les formes de vie les plus abondants sur terre, étant présents dans chaque écosystème, y compris le corps humain. Certaines espèces bactériennes sont également génétiquement très docile et ont été exploités comme modèles de recherche ou pour fabriquer des produits naturels ou synthétiques à l’échelle industrielle. Cependant, pas toutes les espèces bactériennes peuvent être cultivées en laboratoire. Pour ceux qui peuvent, une caractéristique importante est le taux de multiplication, ou « cinétique de croissance ».

Mesurer le taux de croissance de la culture bactérienne peut informer les scientifiques sur leur physiologiques et métaboliques fonctionne et est également utile pour obtenir un nombre précis de cellules de la bactérie pour applications en aval.

Cette vidéo présentera les principes qui sous-tendent l’analyse du taux de croissance bactérienne, démontrer un protocole pour caractériser les taux de croissance avec une « courbe de croissance » et enfin, découvrir plusieurs applications de sciences de l’environnement pour mesurer la cinétique de croissance bactérienne.

Bactéries généralement se reproduisent asexuellement, multipliant par scissiparité simple où une seule cellule parentale se divise en deux cellules-filles identiques. Dans des conditions de croissance favorables où les nutriments sont disponibles en abondance et les paramètres environnementaux tels que la température sont tous propices à la croissance, le taux de multiplication dépasse de loin le taux de mortalité. Cela se traduit par une croissance exponentielle.

En mesurant la quantité de bactéries dans une culture en fonction du temps, une courbe de croissance peut être obtenue. Les bactéries dans un milieu de culture liquide dans des conditions optimales de croissance produit une courbe de croissance avec une forme caractéristique qui peut être divisée en différentes phases. La courbe commence par une « phase de latence », quand la croissance est lente, tandis que les bactéries deviennent acclimatés à des conditions de culture. Suivant est le « journal » ou « phase exponentielle de croissance », quand les bactéries connaître une croissance exponentielle. La croissance cale finalement une fois l’épuisement nutriments et déchets s’accumulent, ce qui entraîne une « phase stationnaire ». Enfin, une fois que le taux de multiplication est dépassé par le taux de mort cellulaire, la culture pénètre dans la « phase de mort ».

Pour construire une courbe de croissance, le nombre de bactéries dans un flacon de culture liquide est comptés à différents moments sur une certaine période de culture. La numération bactérienne peut être obtenue par un certain nombre de différentes méthodes. Une approche courante consiste à mesurer la densité optique - ou « OD » - 600, qui est l’absorbance de la solution bactérienne de la lumière à une longueur d’onde de 600 nm.

Une autre méthode consiste à déterminer le « UFC », ou les unités formant des colonies par millilitre de la culture. En raison de la nature clonale de la croissance bactérienne, une bactérie dans une culture peut théoriquement développer dans une colonie observable sur une gélose. Par une série de dilutions d’une culture bactérienne de placage pour atteindre une concentration bactérienne où les colonies discrets peuvent être observés, une méthode appelée « plating dilution en série », la numération des colonies peut être utilisée pour le dos-calculer la concentration bactérienne en termes d’UFC / mL.

Maintenant que vous comprenez comment la croissance bactérienne peut être analysée, Let ' s go via un protocole pour effectuer une analyse de courbe de croissance sur les cultures pures d’un modèle bien établi bactérien, Escherichia coli, à l’aide de l’électrodéposition méthode de dilution en série.

Un jour avant l’heure point collection, inoculer 20 mL de bouillon préstérilisé trypticase soja ou du BST, moyen dans un ballon jaugé de 50mL avec une seule colonie d’Escherichia coli.

Incuber la culture pendant une nuit à 37 ° C sous agitation. Pour e. coli, cela se traduirait par une population de phase stationnaire d’environ 109 UFC/mL.

Le lendemain, ensemencer 100 μL de la culture au jour le jour dans 250 mL de BST dans un ballon jaugé de 500 mL. Mélanger soigneusement. Il en résulte une culture diluée d’environ 4 x 105 UFC/mL. Stocker 5 mL de cette culture diluée dans un tube à culture. Il s’agit de l’aliquote de temps point 0 ou T0. Réfrigérer immédiatement à 4 ° C.

Incuber le volume restant de la culture à 37 ° C sous agitation. À toutes les heures par la suite pendant 8 h, recueillir des aliquotes de 5 mL de la culture. Désigner ces échantillons T1 T8et stocker la totalité d'entre eux à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.

Le jour de l’expérience, enlevez les aliquotes de point de temps d’e. coli du réfrigérateur et mettez-les sur la glace. Microtubes stériles, chacune avec 900 μL de sérum physiologique stérile, permet de mettre en place une série de dilution pour chaque aliquote conformément au tableau suivant.

Mélange la culture de0 T bien au doucement Vortex, puis ajouter 100 μL de Tube A sa série de dilution, en faisant un 1 sur 10 ou 10-1 dilution. Tube de Vortex A mix, et à l’aide d’un embout de la pipette frais, ajouter 100 μL de Tube A du Tube B, faire le 1-en-100 ou 10-2 dilution.

Répétez le processus pour chaque culture aliquote et font de la série de dilution appropriée selon le tableau 2. Une fois la série de dilution pour tous les échantillons de point de temps ont été faites, le nombre de plaques d’agar stérile trypticase soja ont préparé pour ensemencement bactérien.

3 dilutions de chaque culture de point du temps vont être plaquées en trois exemplaires conformément au tableau suivant. Étiqueter les plaques en conséquence. Puis, pipette 100 μl de chaque culture convenablement dilué vers le centre de la gélose respectifs. Flamme-stériliser une baguette de verre en forme de « L ", cool en touchant la tige à l’agar loin de l’inoculum et immédiatement étaler le liquide sur la surface de la gélose. Veuillez noter que pourrait entraîner un retard dans la diffusion de la pullulation microbienne à l’endroit de l’inoculation.

Continuer l’électrodéposition de chaque série de dilution pour tous 9 fois point de cultures, le verre tige entre chaque série de dilution de propagation de flamme-stérilisation.

Une fois que les plaques ont été autorisés à sécher pendant quelques minutes, retournez et placez-les dans l’incubateur à 37 ° C pendant la nuit. Après cette période de croissance, les plaques peuvent être stockés à 4 ° C.

Après une nuit d’incubation des plaques dilution, examinez-les pour la contamination et l’uniformité des colonies. Pour chaque fois point culture, choisir une dilution pour laquelle il y a entre 30-300 colonies par boîte. Compter le nombre de colonies sur chacune des plaques en triple pour cette dilution.

En utilisant le nombre moyen de colonies pour chaque dilution et le facteur de dilution, calculer la concentration de bactéries dans la culture d’origine à chaque instant en UFC/mL. Par exemple, s’il y a en moyenne 30 colonies de la triple plaque ensemble issu de 0,1 mL de la 10-4, au 1-à-10 000, dilution, puis il serait 30 divisé par 0,1 mL multiplié par 10 000, soit 3 millions CFU/mL.

À l’aide de la concentration bactérienne calculée pour chaque point dans le temps, tracer la courbe du journal de la base 10 de la concentration bactérienne, en UFC/mL, contre le temps en heures. Sur le graphique, d’identifier la phase logarithmique de croissance de la culture d’origine bactérienne et de choisir deux points temps dans la phase logarithmique, qualifiant le premier de ces points dans le temps t = 0. Calculer la durée d’une génération moyenne à l’aide de l’équation X est égal à 2 à la puissance n multiplié par X0 où X est la concentration de bactéries au temps t, X0 est la concentration initiale à t = 0, et n est le nombre de générations qui s’est écoulé entre les deux points de temps.

Par exemple, supposons que X0 est 1 000 UFC/mL et à t = 6 h, que la concentration est de 16 000 UFC/mL. À l’aide de l’équation, nous obtenons que 4 générations ont eu lieu dans les 6 h, ce qui donne un temps de génération de 6 divisé par 4 ou 1,5 h par génération.

Mesure de la cinétique de croissance bactérienne est fondamentale pour de nombreuses applications pour la recherche, l’agriculture ou des fins de bio-ingénierie.

Une utilisation pour connaître le taux de croissance bactérienne est d’autoriser un montant précis d’une culture bactérienne à obtenir pour ensemencer une autre culture ou moyen. Par exemple, certaines cultures, comme les légumineuses, ont besoin d’être cultivées avec des bactéries symbiotiques connus comme les rhizobiums qui colonisent les racines de plantes à former des nodosités et « fixent » l’azote - convertir l’azote atmosphérique en ammoniac, qui peut être utilisé par la plante. Pour des applications agricoles, une quantité connue de rhizobiums est ajoutée à une moyenne de carbone à base de tourbe, qui est ensuite utilisé pour ensemencer les graines de légumineuses pour établir la symbiose plante-bactérie.

Analyse de la croissance permet également d’identifier les espèces bactériennes qui peuvent dégrader les déchets industriels et éventuellement générer des sous-produits utiles. Dans cet exemple, les chercheurs ont étudié comment les milieux de culture additionnés de la liqueur noire, un déchet de pâte de bois et la production de papier, affecté la croissance d’une souche microbienne environnementale.

Les bactéries non seulement démontré une croissance accrue avec la liqueur noire, mais ont également montrent un modèle de croissance « diphasique », indiquant la présence de plus d’une source de carbone dans la liqueur noire que les bactéries peuvent métaboliser. Les composants individuels de la liqueur noire pourraient alors été extraits pour plus d’analyse de la croissance.

Enfin, les mesures de taux de croissance sont également utiles pour caractériser les bactéries qui ont été conçus à des fins industrielles particulières, par exemple, pour l’assainissement de la pollution par les hydrocarbures. Ici, les scientifiques ont créé des souches de bactéries génétiquement modifiées qui contiennent des enzymes pour dégrader les composants d’hydrocarbures de pétrole. Analyse de la croissance a été réalisée, par exemple, pour vérifier que la bactérie machinée a augmenté les taux de croissance que les bactéries normales en présence des hydrocarbures toxiques, ce qui indique une tolérance accrue qui permettra les bactéries machinées de remplir leur fonction de nettoyage de la pollution.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur l’analyse des taux de croissance bactérienne avec des courbes de croissance. Vous devez maintenant comprendre les différentes phases de croissance des cultures bactériennes, comment réaliser une expérience afin d’obtenir une courbe de croissance à l’aide de la collection de points de temps et le placage de dilution en série, et comment l’analyse de la croissance peut être appliqué à des fins industrielles et de recherche. Comme toujours, Merci pour regarder !

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