La différenciation et la Culture de cellules souches embryonnaires

Developmental Biology

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Summary

Mise en culture des cellules souches embryonnaires (ES) requiert des conditions qui préservent ces cellules dans un État indifférencié à préserver leur capacité d’autorenouvellement et pluripotence. Biologistes de cellules souches sont continuellement optimiser des méthodes pour améliorer l’efficacité de la culture de cellules ES et tentent en même temps d’orienter la différenciation des cellules d’ES dans les types de cellules spécifiques qui pourraient être utilisées dans la médecine régénérative.

Cette vidéo décrit les principes fondamentaux de la culture de cellules ES et montre un protocole général de grandir et de cellules d’ES de passage. Nous prenons également un coup de œil à la pendaison drop méthode, qui est utilisé pour différencier les cellules ES. Enfin, cette vidéo va décrire quelques-unes des applications de culture de cellules d’ES et les techniques de différenciation, y compris une méthode utilisée pour générer des fonctionnelles cardiaques muscle cellules in vitro.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Notions essentielles de biologie du développement. La différenciation et la Culture de cellules souches embryonnaires. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Les cellules souches embryonnaires, ou cellules d’ES, ont un certain nombre de propriétés uniques qui les distinguent des cellules adultes ordinaires. Donc, les scientifiques ont mis au point des techniques spéciales de culture à maintenir ou à tirer parti de ces propriétés. Lorsqu’il est cultivé correctement, CSEh peut diviser indéfiniment pour faire plus d’eux-mêmes. Dans le même temps, en modifiant les conditions de culture, les cellules ES peuvent être adressées à se différencier en n’importe quel type de cellule dans notre corps ; Cette capacité des cellules d’ES est appelée « pluripotence. »

Dans cette vidéo, vous allez apprendre à la culture et le passage des cellules ES afin qu’ils maintiennent leurs propriétés uniques, comment induire la différenciation dans ES cellules de types spécifiques de cellules de forme et la manière dans laquelle ES techniques de culture et de la différenciation cellulaire est utilisés et affinée par les chercheurs aujourd'hui.

Avant d’entrer dans les détails des procédures de maintenance de cellules ES, il faut d’abord comprendre ce qui empêche ou disques de différenciation des cellules ES. Afin que les cellules ES à conserver leurs propriétés uniques de pluripotence et auto-renouvellement, ils doivent être cultivés avec des facteurs spécifiques dans leur milieu de croissance qui suppriment la différenciation spontanée.

C’est le plus souvent effectuée en cultivant les cellules ES sur une couche de « feeders », habituellement la souris fibroblastes embryonnaires, ou MEFs. Des cellules nourricières « nourrissent » les cellules ES certains facteurs, comme l’activine A, qui aident à maintenir les cellules ES dans leur état indifférencié.

Récemment, les scientifiques ont également développé des méthodes culture exempte d’engraissement dans lequel ES cellules sont cultivées dans les médias avec les facteurs nécessaires ajoutés dans une recette définie. Cette approche réduit la variabilité et supprime le composant de non-humain de cultures de cellules d’ES, qui est une condition sine qua non pour des applications cliniques.

Une autre caractéristique des cellules d’ES est qu’ils naturellement poussent en grappes ou colonies et ont tendance à avoir des taux de survie faibles lorsque dissociées en cellules individuelles, en particulier les cellules ES humaines. En conséquence, passage des cellules ES humaines généralement nécessite leur maintien en touffes intactes par le biais de mécanique « aléatoire ».

Lorsque les cellules sont cultivées dans des conditions non adhérents, ils forment des agrégats 3D appelés corps embryoïdes ou EBs, dans lequel les cellules se différenciera dans tous les différents types de cellules. En faisant varier les conditions de la différenciation, telles que l’ajout de facteurs de croissance spécifiques au milieu, les scientifiques développent des méthodes pour diriger la différenciation des cellules ES en types cellulaires spécifiques.

Maintenant que vous comprenez que les principes derrière ES entretien et différenciation des cellules, nous allons étudier comment la culture et de passage des cellules ES sur mangeoires MEF.

MEFs sont prélevés sur des embryons de souris de stade précoce et sont puis inactivés par des produits chimiques ou des rayonnements pour les empêcher de diviser davantage. MEFs inactivés doivent être plaqués sur culture de tissus gélatinisé vaiselle au moins une journée avant de commencer à la culture de cellules d’ES. Lorsque les mangeoires sont entièrement réglées, CSEh est décongelés et ensemencé sur les plaques.

Au cours des prochains jours, les cellules ES grandira en grandes colonies. Avant que les colonies commencent à toucher et fusible, la culture ES doit être repiquée. On devrait observer la morphologie des cellules ES pour voir si elles montrent des signes de différenciation. Indifférenciée des colonies ES regarde généralement bien définies et homogène, tandis que les cellules différenciées ressemblerait « pavés » ternes, de forme irrégulière.

Si les colonies afficher 70 % ou plus de différenciation, ou si elles sont rares, mécaniquement découper les colonies indifférenciées et transférez-les vers une nouvelle plaque d’alimentation. Sinon, simplement supprimer les zones différenciées ou colonies et poursuivez le passage.

Une fois que les colonies différenciés ont été nettoyés, les enzymes protéolytiques, comme la collagénase, sont ajoutés pour soulever les cellules de la plaque avec une incubation à 37° C pendant le laps de temps approprié. Les supports neufs ES sont ensuite ajouté à arrêter les réactions enzymatiques. Les colonies sont mécaniquement délogées de la plaque et transférées dans un tube à centrifuger, où ils sont divisés en tailles souhaitées avec douceur de pipetage. Les cellules ES sont recueillies par centrifugation, resuspendues dans médias ES et plaqués sur les plaques de mangeoire préparés.

Après avoir appris à passage de cellules ES, jetons un œil à l’une des techniques plus courantes permettant de différencier les cellules ES en accrochant le corps embryoïdes drop méthode.

Pour commencer, CSEh est décrochés à l’aide d’enzymes protéolytiques comme la collagénase et dilué à la concentration voulue dans des milieux contenant des facteurs de différenciation de la lignée spécifique. La suspension de cellules d’ES est alors déposée en gouttes sur le couvercle d’une boîte de Pétri bactérienne. Le couvercle est placé sur le plat, donc les gouttes de médias vont accrocher à l’envers et laisser les corps embryoïdes développer et inversé rapidement.

Après environ deux jours, les gouttes avec EBs soient collectées et plaqués sur des plaques non adhérents pour la culture des autres. Au point de temps opportun pour la lignée de la cellule souhaitée, corps embryoïdes sont plaquées sur plats gélatinisé vitroplants adhérentes pour davantage de différenciation.

Maintenant que nous avons couvert les techniques de base de la culture et la différenciation des cellules ES, regardons comment ils sont adaptés pour des besoins spécifiques expérimentales.

Comme mentionné précédemment, les cellules ES peuvent être adressées à se différencier en types spécifiques de cellules dans des conditions de culture différentes. Dans cette expérience, les scientifiques produites motoneurones de cellules ES humaines. Cela a été fait par des facteurs premiers ajout à différencier des corps embryoïdes qui orientent vers la lignée neuronale, suivie des produits chimiques et des conditions de placage qui transforment ces cellules spécifiquement dans les neurones moteurs. En utilisant des approches similaires, les chercheurs ont réussi à différencier les cellules ES en battant rythmiquement des cellules du muscle cardiaque.

Parce que la différenciation des cellules ES imitent les événements qui se produisent comme des embryons se développent naturellement, nous pouvons aussi les utiliser pour étudier la biologie du développement embryonnaire précoce. Un des phénomènes étudiés est l’inactivation du chromosome x ou XC, le processus essentiel par lequel d'entre les deux chromosomes est réduit au silence dans chaque cellule d’un mammifère femelle. En visualisant la distribution des spécifique des ARN et des protéines dans l’élaboration d’EBs, les scientifiques ont acquis des renseignements précieux sur la biologie de XCI.

Enfin, afin d’accroître la cohérence et l’efficacité de l’expérimentation de cellules ES, scientifiques cherchent continuellement à concevoir de meilleures techniques pour la culture de cellules d’ES. Une approche consiste à cultiver des cellules ES en une seule couche, appelée type colonie non mise en culture monocouche ou Mr.

N’oubliez pas que les cellules ES humaines tendent à être malheureux quand ils ne poussent pas comme des agrégats 3D ? Les scientifiques ont démontré que les produits chimiques appelés inhibiteurs de ROCK augmentent la survie des cellules ES dissociées, qui leur permettent d’être repiquées dans des suspensions de cellules individuelles et d’être plaqué à haute densité. L’avantage de la technique de Mr, c’est que chaque cellule est plus tout aussi exposé à des facteurs de croissance et d’éléments nutritifs dans le milieu, de réduire l’hétérogénéité au sein de la culture tout en la rendant plus faciles à cultiver des cellules ES en grand nombre.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur la culture et de différencier les cellules souches embryonnaires. Vous devriez maintenant savoir quels facteurs sont importants pour le maintien de cellules d’ES dans leur état indifférencié, et comment nous pouvons profiter de ES cell pluripotence pour générer des types spécifiques de cellules dans un plat. Aller plus loin, les scientifiques travailleront pour développer plus efficaces et bien définies de culture et de la différenciation conditions pour produire des types de cellules spécialisées qui peuvent être utilisés dans des applications de la médecine régénérative. Merci de regarder !

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