Erkennung von reaktiven Sauerstoffspezies

Cell Biology

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Summary

Reaktive Sauerstoffspezies sind chemisch aktiven Sauerstoff abgeleitete Moleküle in der Lage, andere Moleküle oxidiert. Aufgrund ihrer reaktive Natur gibt es viele schädliche Auswirkungen im Zusammenhang mit ungeprüften ROS-Produktion, einschließlich strukturelle Schäden an der DNA und anderen biologischen Molekülen. ROS kann jedoch auch Mediatoren der physiologischen Signalisierung. Es gibt sammeln Beweise, dass ROS spielen eine bedeutende Rolle in alles von der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren zur Vermittlung von entzündlichen Toxizität, das fremde Erreger abtötet und den Körper verteidigen.

In diesem Video werden wir eintauchen in die Zuordnungen zwischen ROS, Stoffwechsel und Krankheit. Nach der Gründung ihrer Bedeutung, werden wir die Prinzipien und ein Protokoll einer häufig verwendete Methode zur Messung der ROS-Ebenen in den Zellen: die Verwendung von nicht-fluoreszierende Sonden gewordenen fluoreszierende auf Oxidation. Zu guter Letzt werden wir einige aktuelle Anwendungen dieser Technik in der Zelle Biologie Forschung überprüfen.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Cell Biology. Erkennung von reaktiven Sauerstoffspezies. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Reaktive Sauerstoffspezies produziert in Zellen haben in Gewebe Homöostase, Zellalterung und Krankheitszustände wie Krebs impliziert worden. Wie der Name schon sagt, ergeben sich diese Moleküle aus Sauerstoff, die natürlich als eine stabile, Dioxygen Moleküls vorhanden ist, da seine Elektronen gepaart sind. Die Zugabe von einem ungepaarten Elektronen macht es instabil und führt zur Bildung von Superoxid-Anion – eine Form von reaktiven Sauerstoffspezies oder ROS. Anders als das Superoxid-Anion gibt es mehrere Arten von reaktiven Spezies mit ungepaarten Elektronen, deren Ebenen die Zelle genau steuern soll.

In diesem Video lernen wir wie reaktive Sauerstoff Spezies zur Zell-Stoffwechsel und Krankheit, erkunden die Prinzipien hinter einem Assay für die Erkennung mit, dass eine fluoreszierende Sonde, und wir über ein allgemeines Protokoll für diese Probe gehen zusammenhängen. Zu guter Letzt werden wir untersuchen, wie Wissenschaftler diese Methode in Experimenten heute umsetzen.

Zuerst lassen Sie uns diskutieren wie reaktive Sauerstoff Spezies produziert werden, und ihren Einfluss im Zellstoffwechsel und Krankheit zu betrachten.

Eine bedeutende Quelle von zellulären reaktiven Sauerstoffspezies ist die Mitochondrien. Normalerweise werden während der Zelle Stoffwechsel Elektronen durch eine Kette von Proteinkomplexen, gipfelnd in der Reduktion von molekularem Sauerstoff, Wasser und gleichzeitige Erzeugung von ATP transportiert. Trotz der außergewöhnlichen Regulierung dieses Prozesses Elektronen heraus, auslaufen, was die Bildung von Superoxid-Anion.

Das Vorhandensein von Superoxid-Anion entstehen schnell andere Formen von reaktiven Sauerstoffspezies, wie Wasserstoffperoxid und Hydroxyl-radikal. Diese radikale, die alle eine hochreaktive ungepaarten Elektronen besitzen, können oxidativ Membranen, DNA und Proteine schädigen. Um dem entgegenzuwirken, unterhält die Zelle eigene antioxidative Vorrat an Enzyme wie Superoxid-Dismutase oder Moleküle wie Vitamin C, die freie Radikale zu reduzieren. Ein Ungleichgewicht in diesem Abwehrsystem führt zu einer potenziell tödlichen positive Feedback-Schleife, wodurch ein Zustand der übermäßigen reaktiven Sauerstoffspezies als oxidativer Stress bezeichnet.

Reaktive Sauerstoffspezies haben in Initiierung und Progression von Krebs impliziert worden. Eine weitere schädliche Wirkung dieser Moleküle ist die Einarbeitung der Zellalterung, auch bekannt als Seneszenz. Die "freie Radikale Theorie des Alterns" schlägt vor, dass reaktive Sauerstoffspezies, die beim normalen Stoffwechsel in den Zellen produziert zellulären Seneszenz und Tod hervorrufen.

Bis jetzt wir diskutierten die negativen Aspekte dieser hochreaktive Moleküle, aber sie haben positive Rollen in Zellphysiologie sowie. Während Immunantworten montieren Fresszellen verschlingen Krankheitserreger, Sie Zellen ein "respiratorischen Burst" während die übermäßigen Mengen von reaktiven Sauerstoffspezies generiert werden, um Krankheitserreger oxidativ abgebaut. Darüber hinaus sie sind notwendigen Zwischenprodukte und Regulatoren für eine Vielzahl von Zelle Signalwege, und können sogar Signal den Tod von Zellen, die Krebs gemacht haben.

Zur Quantifizierung dieser einflussreichen zellulären Oxidantien nutzen Wissenschaftler Moleküle, die bei der Oxidation fluoreszierende drehen. Eine häufig verwendete Sonde, die reaktive Sauerstoffspezies zu erkennen ist H2DCFDA oder Dichlor-Dihydro-Fluorescein Diacetat, ein nicht-fluoreszierende Analogon von Fluorescein. Wenn Zellen hinzugefügt, kann seine Zelle permeationsfähigen Natur passiv bei diffusen.

Dann, intrazelluläre Esterasen katalysieren eine Hydrolysereaktion, die Spaltung von Acetatgruppen führt. Dies macht die Verbindung mehr polar, so dass es innerhalb der Zelle beibehalten wird. Bei der Oxidation, die Entfernung von Wasserstoff-Atomen durch eine breite Palette von reaktiven Sauerstoffspezies beinhaltet, wird nicht fluoreszierenden H2DCFDA in die stark fluoreszierende Dichlor-Fluorescein oder DCF konvertiert. Dies kann zu lesen und durch eine Platte Leser, Durchflusszytometer oder Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert.

Nun, Sie wissen, wie dieser Test funktioniert, mal sehen, wie es in einer Laborumgebung durchgeführt wird.

Start durch die Übertragung von Zellen, gezüchtet in Kulturmedium zu Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, gefolgt durch Zentrifugation zu waschen. Entfernen Sie überstand zu, und fügen Sie die fluoreszierenden Sonde H2DCFDA Lösung. Inkubieren Sie die Farbstoff-geladenen Zellen im Dunkeln, Immunofluoreszenz zu verhindern. Waschen Sie nach der Inkubation der Zellen, um entladen Farbstoff und Transfer Zellen auf eine Platte zu entfernen. Experimentelle oxidativen Stress induzieren können an dieser Stelle hinzugefügt werden.

Wenn Sie bereit sind für die Analyse, können Zellen in der Platte Leser eingefügt werden. Die Anregung und Emission Wellenlängen sind für Fluorescein festgelegt. Nachdem Platten gelesen werden, können Werte analysiert werden. Die Ergebnisse zeigen die relative Menge von reaktiven Sauerstoffspezies zwischen Proben zu bestimmten Zeitpunkten.

Nun, da wir das eigentliche Protokoll untersucht haben, lassen Sie uns schauen wie es in Experimenten heute gilt.

Forscher verwenden oft diese Methode, um die Mechanik der Phagozytose zu untersuchen. Diese Gruppe von Wissenschaftlern wollte die Möglichkeit der Zebrafisch, montieren Sie eine Immune Antwort in den verschiedenen Phasen der Entwicklung studieren. Wie bereits erwähnt, Phagozytose Ergebnisse bei der Erzeugung von hoch reaktiven Sauerstoffspezies oder "einer respiratorischen Burst", das wird verwendet, um Krankheitserreger abzutöten. Da das Enzym NADPH-Oxidase ein bedeutender Hersteller von ROS in phagocytic Zellen ist, induziert diese Wissenschaftler die Burst-Reaktion durch Behandlung von Zebrafisch mit eine NADPH-Induktor. Die Ergebnisse zeigten, dass unter Zebrafisch-Embryonen dessen "platzen" Reaktion provoziert worden hatte, die in 72 Stunden nach Befruchtung Höherentwicklung reaktive Sauerstoff Spezies als die 48 Stunden nach Befruchtung aufwiesen.

Mitochondriale Dysfunktion aufgrund erhöhter reaktiver Sauerstoffspezies ist eine pathologische Funktion vieler Krankheiten. Daher können Forscher mitochondriale Dysfunktion durch Messung von oxidativem Stress identifizieren. Hier Wissenschaftler H2DCFDA auf Neuronen, verladen und dann die Proben auf dem Fluoreszenzmikroskop montiert. Auf Zusatz von einer oxidativen Stressor wie Wasserstoffperoxid angezeigt Zellkörper eine plötzliche Erhöhung der Fluoreszenz, die ein Indiz der mitochondrialen Dysfunktion sein könnte.

Astrozyten sind vorgeschlagen worden, ZNS-Neuronen vor oxidativem Stress zu schützen. Aufgrund dieser Bedeutung soll dieser Forscher einen Test zur Erkennung von oxidativen Stress in Astrozyten im Beisein eines externen Induktor zu entwickeln. Sie taten dies durch Inkubation Astrozyten mit Wasserstoffperoxid und die fluoreszierende Sonde für reaktive Sauerstoff-Spezies-Erkennung. Nachfolgende Fluoreszenz erzeugt wurde mit einem Durchflusszytometer analysiert. Astrozyten für oxidativen Stress aktiviert wurden beobachtet, fallen in eine Region des erhöhten Fluoreszenzintensität gesehen nach rechts verschoben.

Sie haben nur Jupiters Video auf der Erkennung von reaktiven Sauerstoffspezies oder ROS angesehen. Zusammenfassend in diesem Video haben wir die Verbindung zwischen reaktiven Sauerstoffspezies, Zellstoffwechsel und Krankheit diskutiert. Wir untersuchten dann das Prinzip und die Geschäftsordnung ein Test für reaktive Sauerstoff-Spezies-Erkennung. Schließlich erkundeten wir, wie die Forscher ihre Ermittlungen diese Methode anwenden. Die Analyse der noch rätselhaften Rollen von reaktiven Sauerstoffspezies ist von großem Interesse für Zellbiologen und zuverlässige Messung mit fluoreszierenden Sonden erweist sich als von unschätzbarem Wert sein. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

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