Des essais enzymatiques et cinétique

Biochemistry
 

Summary

Cinétique enzymatique décrit les effets catalytiques des enzymes, qui sont des biomolécules qui facilitent les réactions chimiques nécessaires aux organismes vivants. Enzymes agissent sur les molécules, appelées substrats, pour former des produits. Les paramètres cinétiques enzymatiques sont déterminés par l’intermédiaire de tests qui mesurent directement ou indirectement les changements dans la concentration de substrat ou de produit au fil du temps.

Cette vidéo couvre les principes de base des modèles cinétiques et de cinétique enzymatique (y compris les équations de taux). Les concepts régissant les essais enzymatiques sont également discutés, suivie d’un dosage colorimétrique typique. La section applications décrit un test enzymatique par analyse de transfert (FRET) de l’énergie par résonance Förster, caractérisant l’activité de l’enzyme extracellulaire dans l’environnement, et chargée de l’enquête ADN réparation cinétique utilisant molecular probes.

Les enzymes sont des catalyseurs biochimiques qui sont essentielles pour la vie. Des essais enzymatiques sont utilisés pour étudier les propriétés cinétiques de réactions enzymatiques, élucider les effets catalytiques des enzymes. Cette vidéo couvrira la cinétique enzymatique et dosages, passer d’un mode opératoire général et de montrer certaines applications.

Les enzymes sont des protéines ou protéine-comme des molécules qui agissent sur une molécule du réactif, dénommée le substrat. Enzymes réduisent l’énergie d’activation des réactions biochimiques. Cela permet aux réactions de se produire à un taux plus rapide avec la baisse des dépenses énergétiques.

Réactions enzymatiques peuvent être divisées en trois composantes élémentaires. Le premier est la formation de l’enzyme / substrate complexe, formé par la liaison du substrat pour le site actif de l’enzyme. Le complexe peut se décomposer en ses constituants originaux. Il s’agit de la deuxième réaction élémentaire. Sinon, le complexe peut former le produit et récupérer l’enzyme, la troisième réaction élémentaire.

La cinétique d’une réaction élémentaire est donnée par l’équation de droit élémentaire de taux. Équations de taux droit donnent le taux en fonction de la concentration des réactifs et une constante de vitesse. Chacune des réactions élémentaires a une équation de loi taux individuel, avec sa propre constante de vitesse. Ces équations peuvent se ramener à un modèle cinétique dite de l’équation de Michaelis-Menten. Cela donne la vitesse de réaction en fonction de la concentration du substrat ; qui peut être déterminée expérimentalement. Certaines tendances générales pour les réactions enzymatiques peuvent être identifiés à l’aide de l’équation de Michaelis-Menten. À une concentration élevée de substrat, un point de saturation est atteint, appelée Vmax. Ici, le taux est limité par la concentration de l’enzyme totale et le nombre de molécules de substrat une enzyme convertit en produit par avec le temps, également connu sous le nom de kcat. De Michaelis-Menten kcat cinétique est une des deux constantes qui régissent la vitesse de réaction. L’autre constante, KM, est connue comme la constante d’affinité. KM est aussi équivalente à la concentration où la vitesse de réaction est équivalente à un demi Vmax. Une enzyme avec une affinité plus élevée aura une plus faible KM et atteindre les Vmax plus rapidement, alors qu’une enzyme avec une affinité plus faible auront un KM plus haut et prendre plus de temps pour atteindre les Vmax. Sachant kcat et KM permet d’enzymes à comparer. Pour ce faire, nous utilisons un ratio appelé l’efficacité de l’enzyme. Kcat supérieur et inférieur KM entraînent une efficacité accrue, tandis que kcat inférieur et supérieur KM résultats en bas.

Les facteurs utilisés pour élucider la cinétique enzymatique doivent être déterminées expérimentalement. Ces tests sont généralement exécutées en mélangeant une solution d’enzyme et le substrat dans un environnement contrôlé. Observations sont faites en mesurant les changements dans la concentration du substrat, produits ou sous-produits en fonction du temps.

La variation de concentration au fil du temps est utilisée pour déterminer la vitesse de réaction. Afin de déterminer la cinétique, données de fréquence doivent être obtenues à des concentrations plusieurs. Si une parcelle de la vitesse initiale inverse par rapport à la concentration initiale inverse, connue comme le terrain de Lineweaver-Burk, est linéaire, puis la réaction suit une cinétique de Michaelis-Menten. La pente et l’intersection de la ligne permettant la détermination des paramètres cinétiques KM et Vmax, qui peut ensuite être utilisée pour calculer kcat et l’efficacité de l’enzyme.

Maintenant que les principes de la cinétique enzymatique ont été discutées, regardons comment effectuer un dosage enzymatique typique.

Dans cette procédure, un dosage colorimétrique est démontré. La première étape consiste à générer une courbe d’étalonnage, qui fera la corrélation absorbance avec concentration en protéine. Solutions de concentration connue sont préparées avec un échantillon de contrôle. Une solution de développeur qui réagit avec la protéine cible est ajoutée pour produire un composé coloré. Absorbance est mesurée et comploté contre la concentration pour générer la courbe d’étalonnage.

Pour effectuer le test, une concentration de substrat est préparée ainsi que le montant approprié de l’enzyme. L’enzyme et le substrat sont mélangés et incubés pendant un intervalle de temps programmé. pH et la température sont contrôlés avec des blocs de chauffage et de la solutions tampons. Un agent d’extinction est ajouté pour arrêter la réaction. Solution de développeur est ensuite ajoutée aux réactions et mélangée. Les solutions sont ensuite placées dans des cuvettes et l’absorbance est mesurée. La quantité de substrat consommé est déterminée en comparant l’absorbance mesurée à la courbe standard. En utilisant les données recueillies, la réaction initiale taux sont déterminés en traçant la concentration au fil du temps. Enfin, avec les données de fréquence et de la concentration, l’intrigue de Michaelis-Menten est faite. Ceci permet la détermination des propriétés cinétiques de l’enzyme comme efficacité nombre et enzyme de chiffre d’affaires.

Maintenant que nous avons passé en revue un mode OPERATOIRE, regardons autrement analyses et leurs applications.

Dans cette procédure frette analyse est utilisée pour étudier la cinétique d’une protéase hydrolyse d’une liaison peptidique d’une protéine. Ces émissions peuvent être mesurées, permettant une analyse continue et quantitative de la production et de consommation du substrat, aider à la détermination de la cinétique de réaction.

Des essais enzymatiques peuvent être utilisés en sciences de l’environnement pour déterminer les niveaux d’activité de l’enzyme extracellulaire dans l’environnement. Eaux, sols et sédiments peuvent être prélevés dans l’environnement et manipulés dans le laboratoire. Activité enzymatique extracellulaire de ces matériaux peut ensuite être caractérisée à l’aide d’essais enzymatiques. Il s’agit d’un outil utile pour comprendre comment l’environnement traite les matières organiques.

Mécanisme de réparation de l’ADN de la cellule peut être évalué par l’étude de la cinétique des enzymes présentes dans le noyau. Le taux auquel une enzyme supprime les dommages, ou lésions de l’ADN peut être mesuré à l’aide de balises moléculaires fluorescents, qui seulement sont fluorescents lorsqu’elle est liée à des séquences d’ADN uniques. Le niveau de réparation de l’ADN peut être mesuré en temps réel en détectant les produits de clivage fluorescent étiquetés.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur la cinétique enzymatique et dosages. Cette vidéo explique la cinétique enzymatique, couvert des concepts de dosage, passèrent une procédure générale et décrit certaines applications.

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JoVE Science Education Database. L'essentiel de la biochimie. Des essais enzymatiques et cinétique. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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