Overview
Source : Laboratoires du Dr Ian poivre et Dr Charles Gerba - Université de l’Arizona
Démonstration d’auteur : Luisa Ikner
Le spectre de la recherche en microbiologie environnementale est large dans la portée et l’application potentielle. Que le travail soit de laboratoire avec des isolats bactériens connus, ou en matière de prélèvement d’échantillons de sol ou d’eau contenant des isolats bactériens inconnus, la capacité de rapidement et visuellement discerner les populations cultivables d’intérêt reste très importante pour les microbiologistes environnementaux encore aujourd'hui avec l’abondance des techniques moléculaires disponibles pour utilisation. Cette vidéo démontrera une telle technique, appelée coloration de Gram.
Principles
La coloration de Gram est une classique et importante technique de coloration qui reste largement utilisée par les microbiologistes environnementaux. Semblable à une tache simple, il permet pour l’évaluation de la morphologie de la cellule bactérienne (p. ex., cocci, tiges, spore-formeurs), taille et disposition (p. ex., chaînes ou clusters). En outre, il permet à la différenciation des bactéries en deux groupes distincts de principe — Gram négatif et Gram positif — selon la composition de la paroi cellulaire et de la structure (Figure 1).
Coloration de Gram est un processus en plusieurs étapes. Avant la coloration, un frottis bactérien est préparé à l’aide d’une plaque, oblique ou bouillon de culture. La préparation de frottis est séchée et fixée sur une lame de verre propre. La tache principale de violet de gentiane est ensuite appliquée au frottis fixé. Violet de gentiane est une tache de base composée de positivement chargé ions colorées (c.-à-d. les chromophores) qui forment des liaisons ioniques faibles avec la chargés négative des groupes fonctionnels présents dans la paroi cellulaire bactérienne. Après avoir doucement la lame avec de l’eau de rinçage, iode de Gram est appliqué et forme des complexes insolubles avec le violet de gentiane dans la paroi cellulaire. Les complexes de violet de gentiane-iode plus lient avec peptidoglycane, un composant de principe des parois des cellules bactériennes. Suite à un deuxième rinçage à l’eau, un agent de décoloration est brièvement appliqué pour le frottis. Pour les bactéries à Gram négatif, le complexe de violet de gentiane-iode est emporté durant l’étape décoloration, avec des bactéries Gram-positives, conservant la tache pourpre. Un troisième et dernier rinçage est suivi d’un contre-colorant de safranine qui colore les bactéries Gram-négatives roses ou rouges.
La figure 1. Comparaison de la paroi cellulaire des bactéries Gram-positives et Gram-négatives.
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Procedure
1. le prélèvement
- Recueillir des échantillons de sol et le transport au laboratoire pour analyse microbienne.
- Dans le laboratoire, peser un échantillon de 10 g à l’aide d’une balance analytique.
- Diluer l’échantillon 01:10 dans 95 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (10 pièces sol équivaut à 5 parties liquide aqueux) et vortex de mélanger (Figure 2, étape 1).
- Effectuer ultérieures 01:10 sur le sol des dilutions jusqu'à au moins 10-5 g / mL, et plaque de propagation sélectionné dilutions dans réplicats de deux ou trois sur un milieu gélose nutritive faible (p. ex., R2A) (Figure 2, les étapes 2 - 3).
- Incuber les boîtes pendant une semaine à température ambiante (Figure 2, étape 4).
- Sélectionnez une ou deux colonies pour l’isolement et ensemencer sur plaques de gélose fraîche (Figure 3, les étapes 1-3).
- Incuber les boîtes de strie pendant deux ou trois jours à température ambiante (Figure 3, étape 4).
2. préparation des frottis bactériennes
- Observer les plaques strie des colonies isolées.
- Pour préparer chaque préparation de frottis, trempez une boucle inoculer dans l’éthanol, flamme-les stériliser et placer 1 à 2 anses d’eau distillée stérile vers le centre de lames de verre préalablement nettoyé.
- Stérilisez la boucle inoculer à nouveau comme décrit précédemment. Une fois refroidi, prélever une petite quantité de la culture d’une seule colonie isolée et mélangez-le avec les gouttelettes d’eau sur la lame (le frottis doit ressembler à du lait écrémé dilué). La boucle à inoculation doit être refroidie avant l’isolement de la colonie. Une boucle qui est trop chaude qui entraîne la colonie et/ou moyen pour éviter les éclaboussures, qui peut conduire à l’aérosolisation de bactéries. En règle générale, lorsque la boucle est trop chaude pour une utilisation, un « sifflement » sera entendu lorsque appliqué à la gélose ou colonie. Un refroidissement de la boucle peut entraîner également au transfert de la culture-pour-slide moins efficace et les distorsions de la morphologie cellulaire.
- Etaler le frottis sur la surface de la lame mesure environ 2,5 cm x 2,5 cm et laisser sécher à l’air. Il est important pour l’air de séchage pour se produire dans des conditions d’écoulement laminaire. Diapositives pas devraient être soufflés sec de manière à ne pas perturber le frottis. En outre, diapositives ne doivent pas être séchées flamme, afin de maintenir la morphologie cellulaire.
- Après séchage, chaleur fixer le frottis en passant les glissent rapidement dans une flamme 2-3 x. La diapositive ne devrait pas être tenue stationnaire dans la flamme, pour éviter des distorsions de la morphologie cellulaire et/ou de dommages à la lame de verre.
3. coloration de gram
- Fixez la lame à une extrémité à l’aide d’une pince à linge propre.
- Recouvrir le frottis avec cristal violet (colorant primaire) et maintenez-le enfoncé pendant 2 à 3 min.
- Laver soigneusement la lame avec de l’eau distillée. Le jet d’eau ne devrait pas être dirigé contre le frottis afin d’éviter des dommages et/ou au décollement de la lame de verre.
- Recouvrir le frottis à l’iode de Gram et maintenez pendant 2 min, puis rincer doucement la lame avec de l’eau.
- Décolorer le frottis à l’aide d’éthanol à 95 % jusqu'à ce que la tache se lave n’est plus de la lame (cela prend généralement pas plus de 20 s selon l’épaisseur du frottis), puis rincer immédiatement avec de l’eau distillée. Cette étape est essentielle pour éviter une décoloration de la diapositive, qui peut conduire à une fausse gramme tache désignation (c.-à-d., Gram variable).
- Ajouter le contre-colorant (safranine) pour le frottis et maintenez-le enfoncé pendant 30 s. Puis rincer doucement la lame avec de l’eau distillée et éponger avec du papier absorbant.
4. microscopique Observation de diapositives
- Observer les diapositives à l’aide de basse (par exemple, 4 X ou 10 X), haute-sèche (par exemple, 40 X), mais les objectifs à immersion (100 X) d’huile. Pour immersion dans l’huile, ajouter l’huile directement sur le frottis.
- Pour obtenir des résultats représentatifs de bactéries Gram-positives et Gram-négatives, voir Figures 4 et 5.
Figure 2. Dilution et Technique de propagation-Plating. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. Isolement de colonie en utilisant la Technique de plaque Streak.
Figure 4. Bactérie Gram-positive de sol Staphylococcus aureus .
Figure 5. Bactérie Gram-négative de sol Escherichia coli.
Coloration de Gram permet une visualisation rapide de la morphologie bactérienne et large cellulaire distinction parmi une large gamme d’échantillons environnementaux. Pour souiller des bactéries, un frottis uniform est appliqué sur un côté de verre et laisser sécher. Après la chaleur-fixation le frottis, violet de gentiane est appliqué.
Un agent de décoloration rince away le violet de gentiane de cellules Gram négatifs, mais pas de Gram positifs cellules. Un deuxième colorant, généralement la safranine, est employé comme une tache de fond pour visualiser les cellules Gram négatifs. Une fois colorés, les cellules peuvent être évalués pour la morphologie cellulaire, taille et disposition, tels que des chaînes ou des grappes.
Cette vidéo vous montrera comment préparer un échantillon environnemental, isoler l’espèce bactérienne qui s’y trouve et effectuer une coloration de Gram sur les colonies isolées
Coloration de Gram permet de catégorisation de la plupart des bactéries en deux grandes classes structurales : bactéries Gram-positives et Gram-négatives. Alors que les deux classes ont une membrane de plasma phospholipides sous-jacente, la structure de la paroi cellulaire varie considérablement. La paroi cellulaire Gram positive est principalement composée d’une épaisse couche de peptidoglycane, qui est un polymère constitué de sucres et acides aminés. Parois des cellules Gram négatifs ont un amincissement de la couche de peptidoglycane, pris en sandwich entre une deuxième membrane lipidique. Cette membrane externe contient généralement des lipopolysaccharides.
Le violet de gentiane chargées positivement se lie faiblement à la paroi cellulaire bactérienne charge négative. Iode de Gram forme un complexe avec le colorant violet de gentiane, fixant ainsi dans la paroi cellulaire insoluble.
Durant l’étape décoloration, le peptidoglycane dans les cellules Gram positifs est déshydraté, faisant du contrat et de piéger les complexes de violet de gentiane-iode. Dans les cellules Gram-négatifs, l’agent de décoloration compromet la membrane externe, augmentant sa porosité. Cela permet les complexes de violet de gentiane-iode à être emportés.
Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent les bactéries du sol coloration Gram, nous allons voir le processus effectué sur des bactéries du sol en laboratoire.
Après avoir recueilli un échantillon de sol dans le domaine, mettre en laboratoire pour analyse. Affiner l’échantillon avec un tamis et peser 10 g de sol tamisé en utilisant une balance analytique.
Diluer l’échantillon dans 95 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate et vortex pour mélanger. Effectuer des dilutions supplémentaires de 1 à 10, Vortex entre chaque dilution. Transfert des aliquotes d’au moins 3 dilutions successives, sur des plaques d’agarose nutritif faible répétées.
Après stérilisation éthanol-flamme et en appuyant sur le support de refroidissement d’une tige de verre courbé, étaler l’échantillon sur la surface des plaques. Incuber les plaques à température ambiante. Après incubation pendant 3 à 5 jours, sélectionnez la dilution la plus élevée avec des colonies isolées de 30 à 300. Avec une boucle d’inoculation stérile, sélectionner les colonies d’intérêt pour l’isolation.
Ensemencer la colonie sur une section d’une plaque de frais. Stérilisation de la boucle entre les stries, faire stries successifs en forme de zig-zag sur chaque section de la plaque permettant l’isolation ultérieure des colonies individuelles discrètes. Incuber les boîtes pendant 1 à 2 jours à température ambiante.
Pour commencer la préparation des frottis bactériennes, attacher un clip à une lame de verre préalablement nettoyé pour la facilité de manipulation. Pour chaque frottis bactérienne, nettoyer et flamme-stériliser une boucle d’inoculation. Placer 2 anses d’eau distillée stérile vers le centre de la diapositive.
Après la stérilisation de la boucle à nouveau, prélever une petite quantité de la culture d’une colonie isolée et mélanger avec l’eau sur la diapositive. Il est important de refroidir la boucle avant de toucher la culture en tapant sur une portion non inoculée de gélose plusieurs fois. Le frottis doit ressembler à lait dilué. Laisser la lame sécher à température ambiante. Après séchage, chaleur fixer le frottis en faisant passer rapidement dans une flamme.
Une fois sec, Pipeter cristal violet sur le frottis et laisser reposer pour 2-3 min. rincer soigneusement la lame avec de l’eau distillée en visant l’écoulement direct vers le haut de la glissoire, laissant l’eau s’écouler doucement vers le bas. Ne pas diriger le débit d’eau directement sur le frottis.
Colorer avec de l’iode de Gram. Après 2 min, rincer doucement à l’eau distillée. Décolorer la lame avec l’éthanol à 95 % jusqu'à ce que la tache se lave n’est plus loin. Rincer immédiatement avec de l’eau distillée. Vous limiterez ainsi les décoloration excessive le frottis.
Ajouter safranine comme une Counter-tache pour le frottis pendant 30 s. Cela tachera les cellules Gram-négatifs présents. Doucement, rincer à l’eau distillée et éponger avec du papier absorbant. Observer la diapositive qui en résulte avec un microscope. Utilisez d’abord un objectif de faible puissance à faire les ajustement grossier et rechercher une portion idéale d’un frottis avant de passer aux champ-de-vues plus petits des grossissements.
Après la nouvelle imagerie et en ajustant le frottis avec un objectif de puissance moyenne, ajoutez huile d’immersion directement sur le frottis. L’huile est nécessaire pour des objectifs de haute puissance qui offrent les meilleures photographies au microscope. Bactéries à Gram positif apparaîtront bleu ou violet en couleur, alors que des cellules Gram négatifs sera rouges ou rose. En plus de la structure de la paroi cellulaire, forme et la disposition ont été dégagés des résultante des micrographies.
La capacité de Gram coloration afin d’étudier qualitativement les bactéries est importante à un large éventail de domaines scientifiques.
Sol est l’une des sources environnementales dont les bactéries peuvent être isolées et analysés. Pour l’eau potable, la préparation de l’échantillon doit être modifiée. Échantillons d’eau du robinet peuvent être tirés d’un robinet et ensemencés sur milieux de culture qui facilite la croissance des colonies de bactéries diverses, hétérotrophes. Placage sur un support comme R2A, le processus est presque identique à celle du sol.
Pour certaines techniques d’identification bactérienne, les paramètres dépendent du type de la paroi cellulaire des bactéries d’intérêt. Dans cet exemple, le sang du patient septique a été testé et s’est avéré pour être héberger des bactéries Gram-positives.
Avec cette information, sondes d’acide nucléique peptidique spécifique à l’espèce ont été choisis qui crée une liaison avec ARNr des cellules. Ces sondes étaient liés à des colorants fluorescents qui ont été utilisés pour identifier les espèces présentes.
En raison des différences fondamentales dans la structure cellulaire de bactéries Gram-positive et - négative, bactéries ont des réponses uniques à d’autres composés en plus du violet de gentiane. Cette expérience a cherché à isoler le Clostridium difficile, une bactérie Gram positive, des échantillons de matières fécales. Cyclosérine, qui inhibe la croissance des cellules Gram-négatifs, a été ajouté à la gélose. Les cellules Gram-positives qui poussaient sur la plaque a de plus étaient isolé grâce aux autres méthodes.
Vous avez juste regardé introduction de JoVE à coloration de Gram pour les études environnementales. Vous devez maintenant comprendre les avantages du processus et la façon d’effectuer la technique et utiliser les résultats. Merci de regarder !
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Applications and Summary
La coloration de Gram est utilisée dans les nombreux sous-champs de la microbiologie environnementale et clinique. Les scientifiques de qualité de l’eau peuvent utiliser la coloration de Gram comme outil de confirmation pour la détection des bactéries fécales dans les échantillons d’eau. Les isolats bactériens provenant de sols sont Gram coloré afin de caractériser davantage les communautés du sol cultivable. Pour les microbiologistes environnementaux, coloration de Gram sida dans la catégorisation des populations bactériennes selon la structure de la paroi cellulaire. Ceci, à son tour, fournit des informations sur la capacité générale d’une communauté microbienne donnée pour résister à la dessiccation et autres facteurs de stress environnementaux. Connaissance de la désignation de coloration de Gram est également d’importance dans la recherche et le développement des produits désinfectants et autres antimicrobiens, comme les bactéries Gram-positives ont tendance à être plus résistant à l’inactivation par des propriétés chimiques particulières que les bactéries Gram-négatives.
Pour les applications de la microbiologie clinique, la coloration de Gram est utilisée pour confirmer l’identité des agents bactériologiques de la maladie ainsi que les méthodes traditionnelles de diagnostic. Il est aussi très utile quand la culture n’a pas, ou n’est pas une option. Coloration de Gram des échantillons cliniques peut révéler la présence d’agents étiologiques qui pas a pu être observée dans le cas contraire.
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