Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Summary

Tutaj demonstrujemy cytoplazmatyczne mikroiniekcję oocytów Xenopus laevis z substratem importu jądrowego, a także przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą cienkowarstwowej mikroskopii elektronowej.

Abstract

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis, a następnie cienkowarstwowa mikroskopia elektronowa (EM) to doskonały system do badania transportu nukleocytoplazmatycznego. Ze względu na duże jądro i dużą gęstość jądrowych kompleksów porowych (NPC), transport jądrowy można łatwo zobrazować w oocycie Xenopus. Dzięki zastosowaniu tego systemu uzyskano wiele informacji na temat mechanizmów importu i eksportu energii jądrowej (recenzowane przez Panté, 2006). Ponadto zastosowaliśmy mikroiniekcję oocytów Xenopus do przeanalizowania szlaków importu jądrowego kilku wirusów, które replikują się w jądrze gospodarza.

Tutaj demonstrujemy cytoplazmatyczne mikrowstrzykiwanie oocytów Xenopus za pomocą importu jądrowego. Pokazujemy również przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji poprzez cienkowarstwowe EM, w tym preparację, odwodnienie i zatopienie oocytów w żywicy epoksydowej. Na koniec przedstawiamy reprezentatywne wyniki dla oocytów, którym wstrzyknięto mikrokapsyd wirusa polihedrozy nukleowirusa Baculovirus Autographa californica (AcMNPV) lub parwowirusa Minute Virus of Mice (MVM) i omawiamy potencjalne zastosowania tej techniki.

Protocol

Część 1: Przygotowanie oocytów Xenopus do mikroiniekcji

1. Umieść mały kawałek (około 2 cm) jajnika Xenopus laevis w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml roztworu kolagenazy (5 mg/ml kolagenazy w modyfikowanym roztworze soli Barth's bez wapnia: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM_MgSO4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Kolagenaza służy do usuwania komórek pęcherzykowych, które otaczają oocyty.
2. Umieść rurkę na platformie wytrząsarki i delikatnie nią kołysz (przy 100 obr./min) przez godzinę. Ten czas różni się w zależności od różnych partii kolagenazy. Tak więc po godzinie weź małą próbkę oocytów i zbadaj je pod mikrosko....

Discussion

Mikroiniekcja oocytów Xenopus w połączeniu z cienkowarstwowym EM jest wysoce skutecznym narzędziem do badania transportu nukleocytoplazmatycznego. System ten został wykorzystany do odwzorowania różnych etapów importu przez NPC, na przykład interakcji substratu importu jądrowego ze składnikami strukturalnymi NPC, takimi jak włókna cytoplazmatyczne i koszyk jądrowy (sprawdzone przez Panté, 2006). Wykorzystano go również do badania importu jądrowego wirusów replikujących się jądrowo (Panté i Kann, 2002; Rabe i .......