Summary
De studie van de ontwikkelingsprocessen van de ascosporen in Gibberella zeae, een procedure voor de collectie onder steriele omstandigheden wordt gefilmd om het hoogste niveau van informatie voor protocol beschrijving te genereren. Dit moet de reproduceerbaarheid van het experiment, een cruciaal aspect bij het volledige genoom expressie profiel testen worden uitgevoerd.
Abstract
Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is een plant pathogeen veroorzaakt schurft ziekte op tarwe en gerst dat gewas opbrengst en graankwaliteit vermindert. F. graminearum veroorzaakt ook steel en oor rot van maïs en is een producent van mycotoxinen, zoals de trichothecenen dat graan vervuilen en zijn schadelijk voor mens en vee (Goswami en Kistler, 2004). De schimmel produceert twee soorten sporen. Ascosporen, de propagulen als gevolg van geslachtelijke voortplanting, zijn de belangrijkste bron van primaire infectie. Deze sporen zijn gedwongen ontslagen uit volwassen perithecia en verspreid door de wind (Francl et al. 1999). Secundaire infecties worden vooral veroorzaakt door macroconidia die worden geproduceerd door ongeslachtelijke middel op de plant oppervlak. De studie van de ontwikkelingsprocessen van de ascosporen in deze schimmel, was een procedure voor de collectie in grote hoeveelheden onder steriele omstandigheden vereist. Ons protocol werd gefilmd in om het hoogste niveau van informatie voor inzicht in en reproduceerbaarheid genereren; cruciale aspecten bij het volledige genoom gen-expressie profielen worden gegenereerd en geïnterpreteerd. In het bijzonder, de variabiliteit van ascospore kieming en de biologische activiteit zijn afhankelijk van de voorafgaande manipulatie van het materiaal. Het gebruik van video voor het documenteren van elke stap in ascospore productie is voorgesteld om normalisatie te vergroten, voldoen aan de steeds strengere eisen voor microarray analyse. De procedure maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur. Stappen worden aangetoond dat besmetting en voor de tijd synchronisatie van ascosporen te voorkomen.
Protocol
- Wortel-agar (Klittich en Leslie, 1988) werd voorbereid in 9-cm diameter petrischalen.
- Een 2 mm kubus van agar met vers mycelium gekweekt op aardappel-dextrose-agar werd toegepast op het midden van elke petrischaal.
- Culturen werden gekweekt bij 25 ° C en een 12-uur lichtperiode voor 96 uur.
- Een ml van de waterige 2,5% Tween 60 werd aangebracht op het oppervlak van de cultuur (Trail en Common, 2000) en verspreid over de cultuur met een plastic staafje, door voorzichtig op te drukken.
- Perithecia schieten ascosporen ontwikkeld 7-10 dagen na deze inductie behandeling bij bewaring in een vochtige omgeving bij 25 ° C met dezelfde fotoperiode.
- Spore collectie wordt uitgevoerd door het veranderen van de Petri plaat deksel, waardoor perithecia te schieten voor een beperkte tijd (bijvoorbeeld 12 uur) in het donker.
- Steriel water wordt toegevoegd aan het deksel, schorsing ascosporen door zacht stromend water op het oppervlak.
- Ascosporen worden verzameld in steriele Falcon buizen, gewassen en gebruikt voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier wordt gepresenteerd is gebaseerd op eerdere procedures voor perithecial productie van Fusarium spp. (Klittich en Leslie, 1988, Trail en Common, 2000). Standaardisatie van de procedure waarmee grote hoeveelheden ascosporen (voldoende voor microarray analyse) zijn gegenereerd was essentieel voor de reproduceerbaarheid van het experiment. Het is gemeld dat de milieu-factoren, leeftijd en substraat verschillen kunnen de biologische karakter van ascosporen (Beyer en Verreet, 2005) te wijzigen. Daarom is het gebruik van video kan aan het licht kleine details in de manier waarop sporen worden geproduceerd en verzameld die moet vergemakkelijken reproduceerbaarheid. Met name de video van de procedure moet verbetering van het niveau van standaardisatie tussen laboratoria en vergemakkelijken van de vergelijking van de gehele genoom transcriptie studies die ascospore productie vereist. De hoeveelheid RNA die noodzakelijk zijn voor experiment procedure is relatief hoog, zodat een groot aantal Petrischaal moeten synchroon worden verwerkt. Video is een uitermate geschikt instrument als het nodig is om hele genoom transcriptionele studies over nieuwe biologisch materiaal uit te voeren, het instellen van een standaard voor toekomstige experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs danken Karen Hilburn voor een uitstekende technische ondersteuning. Dit project werd ondersteund door de National Research Initiative van de USDA Cooperative State Research, Onderwijs en Extension Service (Award # 2004-35604-14327). Matias Pasquali wordt ondersteund door Branco Weiss Fellowship. De Amerikaanse tarwe en gerst Scab Initiative is ook erkend voor de niet aflatende steun van het onderzoek.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish 9 cm diameter | Tool | |||
| Tween 60 (20%) | Reagent | |||
| Carrot agar (20% w/v organic carrots and 1.5% w/v agar) | Reagent |
References
- Beyer, M., Verreet, J. A. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors. , (2005).
- Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666. , (1999).
- Goswami, R. S., Kistler, H. C. Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515–525. , (2004).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi. Genetics. 118, 417-2013 (1998).
- Trail, F., Common, R. Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study. , (2000).
- Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae. Mycologia. , 67-1101 (1975).
- Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. , (1976).
