تشريح والتسجيل من مفرق العضلية جيم ايليجانس

Summary

تطبيق الكهربية لنقاط الاشتباك العصبي للوصول يوفر قدرا من النشاط متشابك قابلة للقياس الكمي ، ومفيدة في تحليل المسوخ متشابك. توضح هذه المقالة أسلوب تشريح المستخدمة للكشف عن الوصلات العصبية والعضلية (NMJ) من

Abstract

العصبي هو العملية التي من خلالها نقل المعلومات عن طريق الخلايا العصبية إشارات كيميائية إلى أهداف بعد متشابك بهم ، على المقياس الزمني السريع. هذه عملية معقدة تتطلب الكثير من النشاط المنسق البروتينات قبل وبعد متشابك لضمان اتصال متشابك المناسبة ، توصيل الإشارات الكهربائية ، واستهداف وفتيلة من حويصلات إفرازية ، والاستشعار من الكالسيوم ، والانصهار الحويصلة التوطين ، ووظيفة المستقبلات بعد المشبكي وإعادة التدوير وأخيرا ، الآليات. علماء الأعصاب كما ان هدفنا هو توضيح البروتينات التي تعمل في كل من هذه الخطوات وفهم آليات عملها. التسجيلات الكهربية من نقاط الاشتباك العصبي توفير الكمي تلا الأحداث الكامنة الكهربائية التي تحدث أثناء انتقال متشابك. من خلال الجمع بين هذه التقنية مع مجموعة قوية من الأدوات الجزيئية والجينية المتاحة لمعالجة البروتينات متشابك في C. ايليجانس ، يمكننا تحليل التغييرات الناتجة الفنية في نقل متشابك.

وجيم ايليجانس NMJs تشكلت بين الخلايا العصبية الحركية وتحرك عضلات الجسم السيطرة الجدار ، وبالتالي ، المسوخ مع الظواهر غير منسقة locomotory المعروفة باسم (UNC) مفتاحية انتقال كثير من الأحيان متشابك التشويش في هذه المشابك ^1. منذ تمسك المسوخ UNC على إمدادات غنية من مصدر الغذاء البكتيري ، إلا أنها تظل قابلة للحياة ، طالما أنها لا تزال تحتفظ ببعض القدرة على ضخ البلعوم لاستيعاب المواد الغذائية. هذا ، جنبا إلى جنب مع حقيقة أن جيم كما توجد ايليجانس المخنثين ، ويسمح لهم بالمرور على ذرية طافرة من دون الحاجة إلى التزاوج السلوكيات بمزيد من التفاصيل. هذه الصفات ، إلى جانب قدرتنا الأخيرة إلى سجل من الديدان NMJs ^2،3،7 جعل هذا الكائن الحي الذي نموذجا ممتازا للتصدي على وجه التحديد كيف UNC العصبي أثر المسوخ.

الأسلوب ينطوي على تشريح الديدان البالغة شل حركة باستخدام الغراء cyanoacrylic من أجل إجراء شق في جليدة الدودة تعريض NMJs. منذ C. ايليجانس الكبار فقط 1 ملم في الطول يتم إجراء تشريح مع استخدام مجهر تشريح ممتازة ، ويتطلب التنسيق بين اليد والعين. والتسجيلات التي NMJ كامل الخلية يمكن لقط أثار الجهد الفردي خلايا عضلات الجسم الجدار والافراج عن العصبي باستخدام مجموعة متنوعة من البروتوكولات بما في ذلك تحفيز التحفيز الكهربائي ، وعلى ضوء تنشيط قناة رودوبسين بوساطة الاستقطاب ⁴ و ملحي مفرط التناضح ، والتي سيتم ووصف فترة وجيزة.

Protocol

A. إعداد الأدوات المستخدمة لتشريح.

1. غرفة التشريح / تسجيل : نحن عادة بناء غرفة تسجيل لدينا ورقة من أصل 1 / 16 ^عشر المغناطيسي بوصة ، مع وجود ثقب دائري ثقبه المركز الذي هو كبير بما يكفي لاستيعاب قطرها 22 مم دائري من الزجاج غطاء. سوف أبعاد الخارجي للغرفة تعتمد على المسرح الاداة المستخدمة للقيام التسجيلات. على الجانب العكسي من ورقة المغناطيسي ، ونحن نعلق تغطية 48 × 60 ملم زلة ، التي نتمسك بها الغرفة من خلال وضع بيليه المنخفض من الشمع يذوب الأنسجة Paraplax التضمين في كل زاوية من الغطاء زلة تقع بين الزجاج وحجرة . ثم ذاب الشمع الساخن على طبق من ذهب ، بلور مواجهة ، حتى أنه يشكل طبقة الغراء المستمر زلة تغطية للغرفة. لا تترك هذه الخطوة غير مراقب كما الشمع يذوب بسرعة. يجب إزالة غرفة تبريد وبأسرع ما قد ذاب الشمع. ويمكن إزالة الشمع الزائد الذي قد تسربت على طول الحافة الداخلية للتجويف دائري 22mm و باستخدام حافة شفرة حلاقة.
2. زلات تغطية Sylgard المغلفة : يتم إجراء تشريح على 22 مم ، Sylgard المغلفة انزلاق الغطاء الذي يوضع داخل تجويف دائري للغرفة تسجيل. معطف Sylgard يساعد الغراء cyanoacrylic التمسك تغطية زلة عندما الإلتصاق الديدان لأسفل وأيضا بمثابة وسادة الذي كسر ظهر الغراء ماصة تلميح عندما يصبح توصيله. يرصد Sylgard تصل طازجة وفقا للتعليمات بتصنيع (10 قاعدة للسيليكون قطع جزء 1 علاج وكيل وزنا). ثم يتم وضع قطرة صغيرة من Sylgard على كل زلة وتغطية طخت به عبر حافة شفرة حلاقة لجعل السطح حتى. يتم وضع غطاء ينزلق في حاويات مغلفة شقة كبيرة مغطاة وغادرت في فرن درجة 65 درجة ليلا لعلاج.
3. ماصات : عادة ، ونحن نستخدم نفس 1 ملم خيوط القطر الخارجي البورسليكات الزجاج لتوليد ماصات للديدان لصق أسفل ، مما يجعل من شقوق إهاب وتسجيل من العضلات ، وذلك باستخدام مجتذب الكهربائي. فإنه من المستحسن أن تسحب جرة من ماصات قبل محاولة تشريح لأن هذه المرحلة يمكن أن تتطلب العديد من عمليات التبادل السريع الماصات.
4. قضيب الغراء : يتم تحميل الغراء وتطبيقها من طرف ماصة الغراء ، عن طريق الضغط الفم. يتم إدراج ماصة الإلتصاق في واحدة من نهاية قطعة 2 سفح أنابيب البولي ايثيلين مع القطر الداخلي التي تتوافق مع القطر الخارجي للزجاج ماصة (عادة 1 ملم). على الطرف الآخر من الأنبوب يحمل الطرف ماصة إيبندورف التي تعتبر بمثابة قطعة الفم.
5. استخراج ماصة : يجب إزالة الأحشاء من تجويف الدودة الدودة مرة واحدة أحرز شق بشرة. ويتحقق ذلك مع قطعة من أنبوب تعلق على الحافة ماصة إيبندورف مشابهة للقضيب الغراء ولكن في هذه الحالة هو كسر طرف زجاج الخلفي ماصة استخراج البيض بما فيه الكفاية للسماح للأحشاء ويمكن بسهولة بالمكنسة الكهربائية من تجويف دودة.

وباء تشريح

1. في غرفة التسجيل ويوجه قلم الشمع خط دائري بالقرب من محيط الدائرة التي يتم الضغط على زلة تغطية Sylgard المغلفة راسخا في مكانه (Sylgard - معطف تواجه صعودا). هذا الخط الشمع يشل زلة تغطية ويمنع تسجيل من حل تتسرب تحت وطرد زلة تغطية خلال تشريح والتسجيل. ثم تملأ الغرفة مع الحل تسجيل خارج الخلية ويتم وضع العديد من الديدان في مركز باستخدام التقاط الدودة. الديدان سوف تسبح في الحل ، ولكن مع الممارسة ، ويمكن لصقها أسفل هذه الديدان من دون أي إجراءات أخرى مثل تبريد لمنع الحركة. خلال مرحلة التدريب ، ويمكن أن يساعد على ممارسة الإلتصاق الديدان الطافرة التي ضعاف السباحة (مثل المسوخ UNC - 31).
2. ويستخدم الصمغ حاوية من الطراز قبعة PCR عقدت في الشمع أو الطين النمذجة ، من أجل عقد العمل في البورصة cyanoacrylic الغراء. ماصات الغراء ذات أبعاد غيض مماثلة لتسجيل ماصات (عادة ~ 4 megohms المقاومة) وتستخدم لتطبيق الغراء. باستخدام قضيب الغراء ، ويتم شفط كمية صغيرة من الغراء تصل إلى ماصة الغراء ، وذلك باستخدام نطاق تشريح لتصور الطرف ماصة كما هو حتى امتص الغراء.
3. cyanoacrylic الغراء (HistoacrylBlue ، Aesulap) polymerizes على اتصال مع تسجيل حل خارج الخلية ، وبالتالي فإنه من المهم للحفاظ على ضغط إيجابي على ماصة الغراء كما يدخل في دائرة الحل لمنع تصلب والغراء من توصيل ماصة. حالما ماصة الغراء هو في حل الغرفة ، وهو تيار صغير لكنه ثابت من الغراء يحتاج إلى أن يطبق على سطح الفم Sylgard تحت ضغط الرقابة لمنع الانسداد. إذا كان يمكن توصيل ماصة يصبح أحيانا ضرورة الافراج عنها من خلال استغلال بلطف طرف على زجاج sylgard المغلفة. فمن المستحسن أن عليك ممارسة الإلتصاق قبل محاولة الديدان الغراء. إذا كنت تستطيع الكتابة بشكل روتيني اسمك في الغراء على Sylgard ، مع رسائل مصنوعة من خطوط أرق من عرض الديدان كنت على استعداد لبروكسعيد لالإلتصاق إهاب دودة.
4. لدودة الغراء ، واستخدام الضغط الايجابي لنعلق على كمية صغيرة من الغراء على رأس أو ذيل الدودة ودودة التعادل سريعا لأسفل على سطح Sylgard. محاولة إرفاق الدودة بالقرب من مركز للغرفة والديدان صقها جدا بالقرب من حافة سيكون من الصعب التوصل مع ماصات التسجيل. ثم تطبيق دفق مستمر من الغراء على طول الحافة الظهرية للبشرة الدودة من المرفق ابتداء ، مما اضطر دودة في موقف - C مع الفرج التي تواجه الداخل (للتسجيلات العضلات البطنية). وينبغي سد أي ثغرات في هذا الخط في الغراء بحيث يرد بقوة على الدودة ، لمنع الدودة من خلال فصل الخطوة شق بشرة.
5. لجعل شق إهاب ، والتحول إلى ماصة تشريح باليد. ماصة هذا يحتاج إلى أكثر حدة من الغراء / تسجيل ماصات ولها قصيرة ، رمح قوي. باستخدام أعلى التكبير على نطاق تشريح ، محاذاة ماصة موازية للمحور الطولي للدودة وادخال الطرف عن نقطة الوسط على طول الدودة (قرب الفرج) جعل شق في واجهة إهاب / الغراء. هذا شق إصدارات الضغط الهيدروليكي ديدان الأمعاء واجبار البيض من خلال شق نقطة. تواصل خفض إهاب نحو رأس الدودة مع حركة مشابهة لتشريح فتح الرسالة ، حتى تصل إلى البلعوم. تحويل إلى ماصة لاستخراج الفراغ من الأعضاء الداخلية للدودة. بعد تطهير الجرح ، سوف تحتفظ إهاب فتح شكلها أسطواني. استخدام الغراء ماصة جديدة لبقعة اللحام حافة قطع من بشرة أسفل على سطح Sylgard. من المهم استخدام الحد الأدنى من بقع الغراء في هذه المرحلة لتجنب إتلاف أو حجب NMJs.
   ويتعرض الآن للعضلات جدار بطني عصب الحبل والجسم.
6. لإزالة الغشاء الذي يغطي الطابق السفلي NMJs ، تمتص قبالة تسجيل حل خارج الخلية من الغرفة وتطبيق كولاجيناز (0.4mg/ml تسجيل في حل خارج الخلية) لحوالي 10-20 ثانية ، وإزالة ويغسل عدة مرات مع تسجيل الطازجة حل خارج الخلية. شروع في مرحلة التسجيل.

جيم باتش تسجيل المشبك

1. موقف غرفة تسجيل على مرحلة مجهر المتابعة باستخدام حق هدفا 10X إلى مركز الدودة. التحول إلى هدف المياه انبثاق 40X مع مدينة دبي للإنترنت وتأكد من أن عضلات جدار الجسم العصبية والحبل سليمة. موقف الدودة بحيث المحور الطولي للدودة بالتوازي مع الحافة الأمامية للنطاق ، مما يسمح قدم أقطاب من كلا الجانبين الأيسر والأيمن.
2. تصحيح العضلات باستخدام معيار التصحيح ، لقط التقنيات. أقطاب تسجيل من حوالي 4 megohms المقاومة تعمل بشكل جيد. مرة واحدة في القطب يمس غشاء العضلات ، وزيادة الضغط السلبي حتى يتم الحصول على ختم gigohm. لوضع كامل الخلية تسجيل الجهد المشبك ، وتطبيق مزيد من الشفط وانطلق الغشاء تمزق حتى يتم ختم gigohm. في تسجيل جيدة ، وعضلات جدار الجسم من الديدان البالغة من النوع البري وعادة ما يكون السعة الخلية غشاء PF 70 ~ ويمكن تسجيل ستابلي لا يقل عن 10 دقيقة في احتمال عقد -60 بالسيارات مع الحد الأدنى من التيارات عقد (~ 50 السلطة الفلسطينية).
3. الحل تسجيل خارج الخلية يتكون من (مم) : كلوريد الصوديوم 150 ، بوكل 5 ، CaCl ₂ 5 ، ₂ 4 MgCl والجلوكوز 10 ، 5 السكروز ، HEPES 15 (7.3 درجة الحموضة ، ~ 330mOsm). ماصة التصحيح يحتوي على (مم) : 120 بوكل ، KOH 20 ، MgCl ₂ 4 (N - تريس [Hydroxymethyl] mthyl - 2 - aminoethane - حمض السلفونيك) TES 5 ، ₂ ثنائي الهيدرات CaCl 0.25 نا ₂ ATP 4 ، السكروز 36 ، EGTA 5 (7.2 درجة الحموضة ، ~ mOsm 312). ملاحظة : هذه الحلول بشكل مصطنع تحميل خلايا العضلات مع كلوريد ، بحيث مستقبلات GABA بوساطة التيارات الداخل بسبب هروب رأس المال كلوريد في إمكانية عقد -60 بالسيارات. وقد استخدمت هذه الاختلافات على الحلول (انظر المنشورات للحصول على التفاصيل).
4. أثار إطلاق سراحه. عادة نضع الكهربائي ثانية تحتوي على حل خارج الخلية العصبية في الحبل البطني الأمامي لعضلة مصححة. هذا التكوين يتطلب التصحيح فضفاضة كبيرة depolarizing المنبهات (بناء على أمر من 10S فولت) لمدة قصيرة (1 - 2ms) لتحقيق أقصى قدر من الردود اثارت (عادة 2،0-2،5 غ) في البرية من نوع الديدان. القيود المفروضة على هذا النهج هي : 1) يمكن أن يتم تسليم سوى ردود قليلة أثار قبل تلف الحبل بلا رجعة العصبية و2) لأسباب غير معروفة ، ويمكن فقط كوليني ردود أثار أثار استخدام هذا التكوين التحفيز.
5. ضوء تنشيط قناة رودوبسين التحفيز. في الآونة الأخيرة ، فقد ولدت في المختبر جوتشالك الديدان المعدلة وراثيا معربا عن الطحالب المستمدة rhodopsins القناة الذي يزيل الاستقطاب في غشاء على تحفيز الضوء في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية ، اعتمادا على المروج المستخدمة في محرك التعبير ^4. في حالة C. ايليجانس NMJ ، وخطوط متكاملة معربا عن قناة رودوبسين إما في الخلايا العصبية الحركية كوليني أو الخلايا العصبية الحركية GABAergic الآن المتوفرهه. منذ قناة رودوبسين يستجيب فقط للضوء عندما يرتبط ريتينال مفروق مع شاردة opsin ، يجب أن تنمو الديدان المستخدمة في هذا التطبيق على البكتيريا الذي تغلب عليه اسهم مع شبكية العين. ويمكن عندئذ نبضة الضوء الأخضر يمكن استخدامها لتنشيط مرارا رودوبسين قناة تسبب أثار إطلاق سراح أي من أدن تشافيز أو GABA ، اعتمادا على الديدان التي تستخدم المعدلة وراثيا. ويمكن عبر هذه الديدان المعدلة وراثيا في سلالات متحولة. في الاستفادة من هذه التقنية خلال التحفيز الكهربائي السابقة وتشمل : 1) الخفيفة التنشيط لا يسبب الضرر العصبية ، والسماح ليتم تنفيذ العديد من التحفيز وكرر 2) مستدعى الإفراج عن أي درس يمكن أن الخلايا العصبية الحركية GABAergic كوليني مستقل أو أن يكون.
6. مفرط التناضح الناجم عن إطلاق سراح. لقياس حجم تجمع حويصلة بسهولة ، نشره (يعكس تجمع لخص من الحويصلات معبي من كل من NMJ على عضلة مسجل) ، والضغط ماصة تحتوي على حل خارج الخلية مفرط التناضح (معدلة لmOsm 850 ~ بإضافة السكروز إضافية) المستخدمة. الضغط نبض تطبيقات ثانية 1-3 تنتج سيلا من الأحداث في مرحلة ما بعد متشابك غير متزامن باستخدام الحلول القياسية المذكورة أعلاه.

الشكل 1 : نظرة عامة تخطيطي لجيم ايليجانس التشريح والتكوين العصبي العضلي تسجيل

وساترة sylgard المغلفة التي تلطخ قطرة من Sylgard عبر الزجاج وعلاج بين عشية وضحاها يتم وضعها في تجويف دائري للغرفة تسجيل الجاهزة ومغطاة حل التسجيل. يتم لصقها ودودة وضعها في المركز إلى السطح Sylgard بدءا من الرأس أو الذيل ، وتطبيق الغراء على الجانب الظهري من الدودة ، وذلك باستخدام ماصة الغراء. بمجرد اكتمال اللصق ، وهي مجاورة لشق الفرج ، في واجهة بين جليدة والغراء يتم بإبرة والزجاج ، ومددت نحو الرأس (انظر مثقبة خط أحمر). بعد استخراج الأحشاء والبيض من تجويف الجسم ، وعلى حافة قطع من شق هي بقعة ملحومة مع الغراء لSylgard تعريض الأعصاب البطنية (الخضراء) وعضلات جدار الجسم (الحمراء). العضلات البطنية - الأمامي الإنسي إلى الفرج والتصحيح ، وفرضت يوضع القطب تحفيز المنبع على الحبل العصبية.

ممثل النتائج

وتظهر كامل الخلية ، والجدار التسجيلات الجسم العضلات الجهد فرضت لكل من بروتوكولات التحفيز الثلاث المذكورة أعلاه (أثار كهربائيا ، وخفيفة وأثار ردود مفرط التناضح). في جميع الحالات ، فرضت هيئة الجدار البطني الإنسي ، العضلات في -60 بالسيارات. خلايا العضلات وايلد ألف نوع يحمل عادة معدلات عالية من التيارات مصغرة الذاتية في الداخل متشابك حلولنا تسجيل القياسية. ألف باء الاستقطاب 2ms العصبية من الحبل البطني الأمامي يؤدي الافراج المتزامن من عدة نقاط الاشتباك العصبي ، مما أدى إلى استجابة كبيرة من مختلف أنحاء أثار 2-2،5 NA في البرية من نوع الديدان. آثار ممثلا للحق آثار من النوع البري في ألف باء ، وتظهر الافراج متشابك في متحولة غير المنسقة بشدة (UNC - 18). لوحة C يظهر استجابة للضوء أثار من الموصل العصبي العضلي من نوع الدودة البرية معربا عن قناة رودوبسين في الخلايا العصبية كوليني. نبضة ضوء 2ms تنتج عادة استجابة 1،5-1،8 غ. دال الضغط والطرد من المياه المالحة mOsm 850 مفرط التناضح على العضلات ل1S ، تنتج سيلا غير متزامن يمثلون تيارات متشابك مصغرة تجمع بسهولة ، المنطلقة من الحويصلات.

Discussion

وهو مثالي للكائن النموذج الجيني C ، ايليجانس لدراسة انتقال متشابك ، من خلال التحليل الوظيفي من الطفرات في الجينات ترميز البروتينات متشابك. هنا قد وصفنا تقنية التشريح أن يجعل C. ايليجانس NMJs الوصول لتحليل الكهربية. يصور شريط الفيديو المرافق الخطوات الحاسمة في C. ايليجانس التشريح والتكوين تسجيل المعتادة المستخدمة لقياس النشاط متشابك. الخطوات الثلاث التي تشكل أكبر التحديات في تعلم هذه التقنية هي : 1) الغراء دودة الخطوة ، 2) إجراء شق ناجحة ، و 3) التصحيح إلى عضلات جدار الجسم. حالما يتقن هذه ، وهذا التحضير هو قابل للتسجيل في العضلات بعد متشابك في إما المشبك الجهد أو أوضاع الجارية المشبك. ويمكن للمحفزات أثار ردود قياسها بسهولة باستخدام هذا المستحضر تشريح في مجموعة متنوعة من الخلفيات متحولة. نظرا لحجم الدقيقة بالفعل من الدودة البرية من نوع (1 ملم في الطول) ، قد متشابك المسوخ التي لا تصل إلى مرحلة البلوغ أو البقاء هزيل لا تكون قابلة للتشريح هذا النهج. الخلايا العصبية الحركية في الحبل البطني العصب أيضا صغيرة جدا (في الخلية سوما 2-5 ميكرون) ، وتشكل تحديات إضافية لelectrophysiologists ، على الرغم من عدة مختبرات سجلت بنجاح من C. وصف ايليجانس الخلايا العصبية في صيغ مختلفة لإعداد تشريح هنا ^{5 6.}