Summary
Protokoll för vaccinia infektion av HeLa celler och analys av värd och virus genuttryck. Del 3 beskriver processen av fluorescerande märkning förstärkta RNA från både värd och viralt prover av amino allyl koppling av färgämnen. Del 3 av 3.
Abstract
Familjen
Protocol
Del 1: ARNA märkning: Amino allyl kopplingen av färgämnen
- Tillsätt 1μg av ARNA proverna i 1,5 mL mikrocentrifugrör.
- Dammsug torra proverna på låg eller ingen värme tills de är helt torra. Cap varje rör så snart det är torrt - inte strykfria!
- Lägg 9μl koppling buffert i varje rör och återsuspendera ARNA genom att försiktigt vortexa i 1 minut. Centrifugera kort att samla in provet i botten av röret, och låt sedan provet sitta på isen.
- Lägg 22μl hög kvalitet DMSO till varje tub Cy3 eller Cy5 färgämne. En tub med färg är nog för två prover. Den Cy3 färg är för märkning din referens prover, och Cy5 färgen för märkning av dina prover.
- Vortex färgämnen för att blanda väl. Håll färgämnen i mörker tills den ska användas. Bered inte färga tidigare än 1 timme före användning. Se till att inget vatten tränger in i färgen / DMSO mix på någon punkt.
- Tillsätt 11μl av det beredda DMSO / Cy färg till varje prov. Blanda väl genom att vortexa försiktigt.
- Inkubera i 30-45 minuter i rumstemperatur. Täck proverna med aluminiumfolie eller hålla dem i en låda för att minimera exponering för ljus.
- Efter inkubationen, tillsätt 4.5μl hydroxlyamine varje prov för att släcka reaktionen. Blanda väl genom att vortexa försiktigt.
- Inkubera 15 minuter vid rumstemperatur. Täck proverna med aluminiumfolie eller hålla dem i en låda för att minimera exponering för ljus.
Del 2: Märkta ARNA sanering
- Vortex RNA-bindande pärlor kort att få en jämn blandning före användning.
- Förbered ARNA Bindning Mix i rumstemperatur. (Tabell 1)
- Blanda väl genom att vortexa.
- Aliquote den ARNA Elution bufferten i ett 1,5 mL rör och inkubera vid 50-60 ° C i minst 10 minuter.
- Tillsätt 70μl av ARNA bindande mix till varje prov och blanda väl genom att pipettera upp och ned 3-4 gånger.
- Överför proverna från PCR-plattan till en 96-väl runt bottenplattan.
- Tillsätt 50μl av 100% isopropanol till varje prov och blanda väl genom att pipettera upp och ned 3-4 gånger.
- Skaka försiktigt plattan på en skakapparat i minst 2 minuter för att blanda proverna.
- Flytta plattan till en magnetisk stå för att fånga den magnetiska pärlor. Låt plattan på stativet tills blandningen blir transparent och bindande pärlor har pelleterat.
- Försiktigt aspirera supernatanten med en vakuum aspirator utan att störa magnetiska kulor. Alternativt försiktigt bort supernatanten med en pipett och kassera supernatanten. Supernatanten bör vara antingen en ljust rosa eller ljust blå på denna punkt på grund av de enskilt ägda färg molekyler.
- Avlägsna plattan från den magnetiska monter.
- Lägg 100μl ARNA tvättlösning i varje brunn och skaka plåten i 1 minut på skakapparat i måttlig hastighet. Pärlor kanske inte helt skingra i detta steg.
- Flytta plattan till en magnetisk stå för att fånga den magnetiska pärlor.
- Försiktigt aspirera supernatanten med en vakuum aspirator utan att störa magnetiska kulor. Alternativt försiktigt bort supernatanten med en pipett och kassera supernatanten.
- Avlägsna plattan från den magnetiska monter.
- Upprepa tvätta en 2: a gången med 100μl ARNA tvättlösning.
- Efter 2: a tvätta, torka pärlor genom att skaka plattan i 1 minut på skakapparat vid högsta hastighet. Låt inte strykfria prover!
- Eluera ARNA från kulorna genom att lägga 20μl förvärmd ARNA Elution buffert i varje prov.
- Skaka plattan på skakapparat i 3 minuter, sedan kontrollera att de magnetiska kulor är helt utspridda. Om inte, fortsätter skaka.
- När magnetiska kulor har helt skingrade, flytta plattan till en magnetisk stå för att fånga den magnetiska pärlor. Supernatanten innehåller städas upp, märkt ARNA prover, och bör vara antingen en ljusrosa eller ljusblå.
- Försiktigt överföra elueras ARNA till en ny PCR-platta (eller PCR-rör).
- (Valfritt steg) Kontrollera RNA-koncentrationen och mängden färg i proverna genom att mäta 1.5μl på en NanoDrop spektrofotometer med microarray-modulen.
- Omedelbart hybridisera märkt ARNA på en microarray-plattform i ditt val, eller alternativt kan du lagra den märkta ARNA vid -80 ° C tills du är redo för hybridisering.
Tabell 1 ARNA Bindande Mix
| Reagens | Belopp för en reaktion |
| RNA Bindande Pärlor * | 10μl |
| Bead resuspension lösning * | 4μl |
| 100% isopropanol ** | 6μl |
| ARNA bindningsbuffert Concentrate | 50μl |
* Blanda RNA bindande pärlor medpärla resuspension lösningen först
** Tillsätt isopropanol och blanda väl innan du lägger till ARNA bindningsbuffert koncentrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg
När du utför aminosyran allyl kopplingen, är det viktigt att resuspendera färg i DMSO kort (mindre än 1 timme) före kopplingen och se till att inget vatten kommer in i färgen / DMSO mix, eftersom det kommer att reagera med den aktiva gruppen på färgen. Låt inte strykfria RNA (kan torkas ner till 1-2uL snarare än helt torr), och återsuspendera bra i kopplingen buffert. Under kopplingen reaktion, hålla reaktionen i mörker, med enstaka snärta och spinn ner om så önskas.
Ansökan / Betydelse
Den märkta RNA till följd av detta protokoll kan hybridiseras till mänskliga, virus eller anpassade microarrays att bedöma svaren genuttryck för att infekterade celler i kultur. Microarray plattformar varierar, så följ tillverkarens anvisningar för beredning av hybridisering blandning från märkta sonden.
Med hjälp av en specialgjord poxvirus rad 1, kunde vi klassificera gener i den allmänna kategorier av "tidiga" eller "sen" bygger på tidpunkterna för hybridisering signal och huruvida viralt DNA replikation krävdes för avskrift upptäckt. Vi observerade den förväntade funktionella kategorier av gener i varje temporala klass (dvs. förväntad tidig, mellan-och sena gener) variation den exakta tidpunkten för transkription.
De metoder som används i detta arbete kan förutse viruset gener transkriberas tidigt eller sent i replikering cykel, men har svårare att skilja tidiga bara kontra gener med en tidig och sen promotor sedan avskrifter med en dubbel tidigt / sent promotor kan kvarstå och vara upptäcktes vid sena tider. Dessutom kan genomgång transkription av sena virala gener påverkar signal vid en viss sond / fläck på arrayen, vilket RNA hybridisering att arrayen kan ha kommit från den utsedda ORF eller en uppströms ORF. Plattsättning arrayer har försökt att lösa detta problem, men utmaningar återstår att upptäcka köra genom transkription med hybridisering strategier 2,3,4.
Värd transkriptionell mönster kan också bedömas med hjälp av dessa metoder. Men kodar vaccinia en mängd mekanismer för att hämma värd svar, och värd transkriptionell svar kan bli lägre jämfört med andra stimuli 5,6,7,8. Eftersom uttrycket av många gener inblandade i värd försvar förändras efter infektion, bör bidraget av virala gener som motverkar värd immunsvaret därför beaktas.
Med hjälp av dessa metoder kan en karta över transkriptionell timing av alla virala gener kan identifieras och användas för att förhöra funktioner okända virala gener. Dessutom kan dessa metoder användas för att dissekera den intrikata dialogen mellan virus och värd. Dessa metoder är i stort sett tillämpas på andra värd-patogen infektion system. Om den patogen av intresse inte har polyadenylated mRNA, kan alternativa metoder användas för att direkt märka totala RNA, utan linjär förstärkning. Genom att analysera både värd och virus genuttryck under synkron infektion, dessa metoder ger oss möjlighet att få inblick i virus interaktion med värden cellulära miljön liksom värd counter-försvar mot virusangrepp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Whitehead Institute Fellows Fonder
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
